Pyrosequencing הוא ריצוף על ידי סינתזה טכניקה אשר ניתן להשתמש בו כדי גנוטיפ יחיד נוקלאוטיד פולימורפיזמים ב DNA מיטוכונדריאלי. שיטה זו מועילה בקלות היישום שלה וחסכונית בהשוואה לשיטות ריצוף אחרות. זה יכול בקלות לשמש כשיטת אבחון עבור מחלות מיטוכונדריאליות מסוימות על ידי קביעת ערכים הטרופלזמה של וריאנטים פתוגניים ב- DNA מיטוכונדריאלי.
כדי להתחיל, קבל קובץ רצף DNA מיטוכונדריאלי עבור המינים העוברים גנוטיפ וזהה את המיקום של פולימורפיזם הנוקלאוטיד היחיד, או SNP. ודא שרצף הייחוס המשמש משתמש במספור הבסיס המתאים למוטציה שנחקרה, כך שניתן יהיה לזהות בקלות את מיקום ה- SNP. העתק 1, 000 זוגות בסיס במעלה ובמורד הזרם של אתר SNP והדבק את הרצף החתוך לתוך תוכנת עיצוב פריימר pyrosequencing.
סמן את הבסיס הפולימורפי, לחץ עליו באמצעות לחצן העכבר הימני ולאחר מכן בחר הגדר אזור יעד כדי להגדיר את בסיס SNP מנותח כיעד של בדיקת pyrosequencing. לחץ על סמל Play בפינה השמאלית העליונה של הממשק כדי להפעיל את בחירת הפריימר, והמתן עד שהתוכנה תיצור באופן אוטומטי את שלישיות הפריימר, שני פריימרים להגברה מראש של DNA התבנית, והפריימר השלישי לריצוף על ידי הסינתזה במכונת pyrosequencing. לחצו לחיצה ימנית ובחרו 'העתק את כל ערכות הפריימר' כדי לשמור על כל ערכות הפריימר.
פתח את תוכנת ההפעלה שסופקה עם pyrosequencer, בחר New Assay ולאחר מכן בחר את תבנית בדיקת כימות האלל. הזן את הרצף שיש לנתח בתיבה המתאימה על ידי הקלדת הנוקלאוטידים ישירות במורד הזרם של פריימר הרצף. עבור מיקום המשתנה, ציין את שני הבסיסים האפשריים, מופרדים באמצעות קו נטוי.
לחץ על Generate Dispensation Order ותן לתוכנה לקבוע באופן אוטומטי סדר מתאים עבור הנוקלאוטידים שיופקו ברצף על ידי תגובת סינתזה. שמור וספק שם עבור הבדיקה. לאחר מכן, בצע את הריצה על ידי דילול ה- DNA כדי להיות מנותח ל 5 ננוגרם למיקרוליטר.
בסיבוב הראשון, הקפד לכלול דגימות של הטרופלזמה ידועה כהתייחסות ודגימות מסוג פראי. לאחר מכן לבצע PCR preprequencing של 5 מיקרוליטר של DNA מדולל ו 25 מיקרוליטר תגובות, באמצעות פריימרים הגברה ופרמטרים. כדי להפעיל את הגדרת הקובץ, בחר הפעלה חדשה בתוכנת pyrosequencer.
הפירורצף יכול לרצף בו זמנית 48 תגובות מוגברות נפרדות עם ריבוע ריק המייצג היטב רצף יחיד על דיסק pyrosequencing. טען את הבדיקות על-ידי לחיצה ימנית על ריבוע ובחירה באפשרות טען מבחן. במידת הצורך, רצף עד ארבע בדיקות נפרדות עם פריימרים שונים לריצוף.
הגדר את מצב חלוקת הפריימר לאוטומטי כדי להקצות אוטומטית תא הזרקה לכל פריימר רצף המשמש לריצה. הגדר את מצב הפעלה לרגיל, אלא אם כן פועל ארבעה סוגים שונים של בדיקות בדיסק רצף אחד. ודא שמספר הבדיקות בקובץ תבנית ההפעלה תואם למספר תגובות ה- PCR המוגברות.
לאחר מכן שמור את קבצי ההפעלה בכונן USB. כדי להפעיל את הפירורצף, לחץ על כפתור הניקוי במסך המגע הראשי של המכשיר ונקה את כל המזרקים במים בעלי טוהר גבוה, בהתאם להוראות שעל המסך. בעת הכנסת פס הבולם למכונה, יש לוודא שהקצוות נפגשים במצב השעה 9.
לאחר חיבור מקל ה- USB, לחץ על רצף כפתור כדי לטעון את קבצי ההפעלה שהוכנו קודם לכן. בצע את ההוראות שעל המכשיר כדי לטעון ולהעביר את הריאגנטים, לפי הצורך, למזרקים המתאימים במכשיר. טען 3 מיקרוליטר של חרוזים לתוך הבארות, ולאחר מכן לטעון 10 מיקרוליטר של כל תגובת PCR כדי להיות רצף לתוך המדגם המתאים.
פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את הדגימה עם החרוזים המגנטיים. חפש את האינדיקציה בפירורצף הראשוני שניתן לטעון את הדיסק למכונה. פתחו את הברגת הצלחת המחזיקה את האגוז, ויישרו את צלחת הדגימה הטעונה עם פין המתכת בתא הדיסק.
לאחר הברגת הצלחת בחוזקה לתא הצלחת, הפעל את ריצת הרצף על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בממשק מסך המגע. לאחר השלמת ההפעלה, הסר את כונן ה- USB מהמכשיר וחבר אותו בחזרה למחשב שבו פועלת תוכנת הפירורצף. לאחר שקובץ ההפעלה החדש שנוצר מופיע בכונן ה- USB, לחץ פעמיים על קובץ הפעל תוצאות.
זה מנתח באופן אוטומטי את תפוקת הלוציפראז של כל באר עם שילוב הנוקלאוטידים, ומכמת את האלל המיטוכונדריאלי המעניין. חפש את ציוני הצבעים המוצגים על ידי התוכנה בהתבסס על איכות הקריאות. כדי לשמור את התוצאות, בחר דוחות בחלון העליון, ולאחר מכן דוח מלא כדי ליצור קובץ PDF המכיל פירוגרמות ותוצאות מכל באר של הרצה.
לחלופין, הורד את התוצאות בפורמטים אחרים תחת הכרטיסיה דוחות. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של הגברה PCR באמצעות פריימרים להגברה משתי הקבוצות שנבחרו עבור מוטציית m. 3243A>G כפי שמוצג באיור זה.
כאן, Het מציין את מדגם m. 3243A>G כמעט הומופלסמי שיש לנתח. השוואה של הביצועים של שתי ערכות הפריימר באמצעות תקנים מולאריים לכיול מוצגת באיור זה.
הערכים הנמדדים מסומנים בקווים האנכיים המקווקוים. פונקציה ליניארית X=Y מוצגת כדי להמחיש עד כמה כל אחד משני המבחנים שנבדקו קרוב למדידה אידיאלית. שמות קווי התאים על ציר ה-X הם שמותיהם של שיבוטים שונים של ציברידים שעברו גנוטיפ באמצעות בדיקה זו.
תוצאות גנוטיפ על ארבעה שיבוטים של ציבריד של הטרופלזמה לא ידועה m. 3243A>G באמצעות שתי הבדיקות מוצגות כאן. הרצף בוצע בשלשה טכנית.
תוצאות גנוטיפ של תאים שטופלו בנוקלאז אצבע אבץ מיטוכונדריאלי, יחד עם בקרות לא מטופלות ומטופלות דמה, והפירוגרמות משני שכפול PCR של דגימת תאי MEF המשמשים ליצירת התוצאות, כמו גם בקרת הגנוטיפ מסוג פרא מוצגות כאן. Pyrosequencing יכול לשמש כקריאה לניסויים בתרפיה גנטית להערכת טכנולוגיות ריפוי גנטי שונות ב- DNA מיטוכונדריאלי.
