ההשפעה של גורמים מיקרו-סביבתיים על התנהגות התאים נחקרת לעתים קרובות באמצעות פלטפורמות פשטניות מדי במבחנה, המבודדות רמזים בודדים. הגישה שלנו יוצרת מצעי תרביות תאים המשלבים מספר רב של רמזים אלה. גישה זו היא רב-תכליתית ביותר ומאפשרת מחקר שיטתי תוך שימוש במגוון רחב של חומרים מתרביות תאים, דפוסי הנחיית מגע, קריאות תאיות וחלבונים.
ההליך יודגם על ידי שני מועמדי PSE מהמעבדה שלנו. CAS VAN DER PUTTEN, ו- MIRKO D'URSO First, יוצרים תבנית זכוכית שלילית באמצעות טכניקת לייזר ישירה של פמטו-שניות המכילה את כל התכונות המעניינות. לאחר מכן, מניחים בזהירות את תבנית הזכוכית השלילית בתחתית צלחת פטרי ויוצקים את הפולימר הקדם-פולימרי Polydimethylsiloxane על גבי תבנית הזכוכית השלילית כדי לכסות אותה לחלוטין.
מניחים את צלחת הפטרי הזו במייבש הוואקום ומפעילים את משאבת הוואקום. לאחר השגת ואקום, יש להמתין 5 דקות כדי להסיר את כל הבועות הקיימות בממשק שבין משטח התבנית לבין הפולימר הקדם-פולימרי פולידימתילסילוקסן. לרפא את הפולימר PDMS לפני לילה בתנור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
לאחר הריפוי, השתמש מרית כדי להרים את הקצוות של PDMS. הסר את שבב ה- PDMS החיובי שזה עתה נרפא מתבנית הזכוכית השלילית, ואם שבב ה- PDMS החיובי נוטה להידבק לתבנית הזכוכית השלילית, הוסף אתנול או מים לשולי החותם בעת ההרמה. לאחר מכן, מניחים את שבב Polydimethylsiloxane חיובי ב desiccator ליד בקבוקון קטן עם טיפה של סוכן silanization, ולהשאיר את השבב תחת ואקום לילה.
שפכו קדם-פולימר PDMS לתוך תבנית PDMS שלילית כדי לייצר שבבי תרבית תאים מרובים בעובי 5 מילימטר. לאחר מכן, להסיר את הבועות באמצעות desiccator ולרפא במשך שלוש שעות ב 65 מעלות צלזיוס. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את השבב לגודל הסופי ולאחסן את השבבים בטמפרטורת החדר עבור פסיבציה של המצע באמצעות פינצטה, הנח את השבב בסלסלה של אשר פלזמה.
לאחר מכן, השתמש בפלזמת חמצן כדי להפעיל את קבוצות ההידרוקסיל על פני השבב ולאוורר את תא האפר באמצעות חנקן. הוציאו את השבב מהסל והניחו אותו במיכל פולידימתילסילוקסן קטן. עכשיו, להשתמש פיפטה פסטר כדי להוסיף 500 microliters של Poly-L-ליזין על החלק העליון של השבב, כדי לטבול לחלוטין את פני השטח בתמיסה דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להסיר 450 microliters של Poly-L-ליזין מן שבב תרבית התא עם פיפטה. לאחר מכן, לשטוף את פני השטח שבב trice עם 500 microliters של 0.1 טוחנת HEPES חיץ. שמור על איכות התבנית הסופית על-ידי השארת נפח קטן של נוזל על שבב Polydimethylsiloxane, כדי למנוע ייבוש הדגימה.
רגע לפני השימוש, הכינו 500 מיקרוליטרים של 50 מיליגרם למיליליטר מתוקסי פוליאתילן גליקוזיק תמיסת ולרט ציאנמידלית ב-0.1 ערימות טוחנות לכל שבב תרבית תאים ודגרו את הדגימה בו למשך 60 דקות. באמצעות מיקרו פיפטה, הסר 450 מיקרוליטרים של תמיסת פוליאתילן גליקוזית ציאנאמידלית של מתוקסי פוליאתילן. שטפו את משטח השבב חמש פעמים עם PBS על ידי צנרת פנימה והחוצה.
כדי להסיר את כל mPEG-SVA הלא מאוגדים. הניחו את מגלשת הזכוכית עם עט סימון פלואורסצנטי בנתיב האופטי של המיקרוסקופ. עברו למצב פלואורסצנט במיקרוסקופ ומקדו בזהירות את תמונת הפרימו כדי להבטיח שגם הלוגו וגם הטקסט יהיו בפוקוס.
לחץ על הבא כדי לראות את נתוני הכיול והתבנית כדי לסיים את הליך הכיול. רשום לעצמך את מיקום Z של השלב בעת הכיול והשתמש במיקום זה כהפניה בהמשך הפרוטוקול. לאחר הסרת שקופית הכיול מהבמה מניחים שקופית זכוכית המכילה טיפה של יוזם הצילום על הבמה ומניחים את מצע תרבית תאי PDMS הפוך, בטיפה של יוזם התמונה.
ודא שהתכונות התלת-ממדיות על פני השטח של מצע תרבית התאים פונות למגלשת הזכוכית ושקועות לחלוטין ביוזם התמונה, כדי להבטיח דפוס תקין. התמקדו בחלק העליון או התחתון של מבנים קמורים או קעורים בהתאמה והתמקדו באזור השבב במיקום הנכון כמתואר בכתב היד. התאם את הגדרות התבנית בהתאם לתכונה ובחר מנה של 1000 מילי-ג'אול למיליליטר.
לחץ על כפתור ההפעלה בתחתית הימנית של המסך כדי להתחיל את התבנית. לאחר סיום, שימו לב לתבנית המוצגת בירוק. באמצעות מיקרו פיפטה, להוסיף שני מיליליטר של PBS לבקבוקון של 20 מיקרוגרם של רודמין שכותרתו פיברונקטין, כדי לקבל ריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר.
פיפטה בעדינות כדי למנוע את גושי החלבון ולהגן מפני אור. באמצעות מיקרו פיפטה, הוסף 200 עד 500 מיקרוליטרים של תמיסת החלבון לשבב תרבית התאים. התאימו את זמן הדגירה והטמפרטורה בהתאם לחלבון המועדף, והקפידו לכסות את הדגימה.
הסר את תמיסת החלבון ולשטוף את השבב חמש פעמים עם 500 microliters של PBS סטרילי. הקפידו להעלות ולרדת את ה-PBS מספר פעמים מעל כל התכונות הרלוונטיות של שבב תרבית התאים, כדי להסיר כל חלבון לא מאוגד. לאחר הכנת השעיית התא, הסר PBS והוסף 1 מיליליטר של השעיית התא לשבב.
לאחר מכן, לדגור אותו במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בדוק את הידבקות התאים על שבב תרבית התאים בתבנית תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. חפש מורפולוגיות של תאים מוארכים במקרה של תבניות קו.
ואם תאים התחילו להידבק מחוץ לאזור המעוצב, הסר אותם על ידי הזרמת התווך למעלה ולמטה ישירות מעל התאים על המצע. לאחר ההכתמה, הניחו את הדגימה המוכתמת במהופך בטיפה של PBS על מגלשת זכוכית. לאחר מכן, בהתאם לרמת הפירוט הנדרשת, צור ערימות Z עם מטרה מתאימה וריווח Z כדי להבטיח רכישת תמונה נכונה.
צור עיבוד תלת-ממדי של מחסנית Z באמצעות תוכנת עיבוד תלת-ממדית. בור קעור עוצב באמצעות בליעה מולקולרית של חלבונים המושרה על ידי אור, וההדמיה של הקרנה בעוצמה מרבית וראייה אורתוגונלית. פרופיל העוצמה הראה מעברים חדים ברזולוציית דפוס גבוהה בין אזורים מעוצבים ולא מעוצבים ועוצמת חלבון עקבית.
התבנית באמצעות מישור המוקד הבודד, כמו גם שיטת שניים ושלושה מישורי מוקד הראו יישור מושלם של התבניות על גבי התכונות. הצילינדרים למחצה הקעורים, הצילינדרים למחצה הקמורים, משטח האוכף וה- PID עוצבו באמצעות קווים או מעגלים קונצנטריים ברוחבים שונים. ההשפעה בתוך השלד של הקרטוציטים האנושיים מוכתמת באמצעות עלווה ומדומה.
הפיברובלסטים העוריים היו מתורבתים על חצי גליל קעור בתבנית ודמיינו. התאים חשו ודבקו במצע תרבית התאים מרובה הרמזים ונשארו בני קיימא לאורך זמן כפי שדמיינו F-אקטין, וינקולין וגרעינים. כמו כן, התאים יצרו הידבקויות מוקדיות בעיקר על קווי הפיברונקטין.
הפיברובלסטים העוריים האנושיים שגודלו על גליל קעור מעוצב בנוכחות רודמין פיברונקטין דבקו במצע הרב-רמזים והראו תגובת יישור, בהתאם לדפוס הנחיות המגע. תגובת היישור וכדאיות התא נשמרות לאורך כל משך התרבית. הדבר החשוב ביותר בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא למנוע את פני השטח של שבב תרבית התא להתייבש.
השימוש בחומרי מצע שונים, ציפויי חלבונים וסוגי תאים עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת. מתן רמזים סביבתיים מרובים בתלת-ממד יכול לפתוח אפשרויות חדשות להיגוי הארגון התאי ברקמות הנדסיות מורכבות.
