פרוטוקול זה מאפשר ייצור של אנלוגים לעצם ללא צורך בחימום או כימיקלים רעילים. בדרך זו, מבנים עצם נוצרים עם פוטנציאל לתיקון פגם עצם במסגרות קליניות באמצעות התאים של המטופל עצמו. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שניתן להדפיס את דיו העצם עם תאים חיים כדי ליצור כל מבנה מורכב דמוי עצם ולכוון את ההתמיינות לעבר שושלת יוצרת עצם.
יתר על כן, ניתן להעמיס תרופות לתוך דיו העצם כדי לשפר בו זמנית את ריפוי הפצע, התחדשות העצם, ולטפל פתולוגיות כמו סרטן. מי שידגימו את ההליך יהיו גאגאן ג'לנדהרה, דוקטורנטית במעבדה שלי, וד"ר שרה רומנאצו, שעבדה איתי ועם ד"ר ג'לנדהרה על פרויקטים שונים, כולל פיתוח טכנולוגיה זו. התחל על ידי הוספת תערובת סידן מימן פוספט ואבקת סידן פחמתי לכור היתוך זירקוניה כך שהוא לא יותר מ 75% מלא.
מעבירים את כור ההיתוך לכבשן, מחממים אותו ל-1, 400 מעלות צלזיוס בקצב של חמש מעלות צלזיוס לדקה ומחזיקים שלוש שעות. להרוות את התגובה על ידי הסרת כור ההיתוך מן הכבשן ולהשאיר בראש בלוק עקשן. תנו לו להתקרר לחלוטין לפני הטיפול.
השתמש טיט ומזיק כדי לשבור ולטחון את עוגת אלפא טריקלציום פוספט, כך גרגירים וכתוצאה מכך יש גודל מקסימלי של 200 מיקרומטר. הוסיפו שלושה כדורי זירקוניה מיוצבים ביטריה לתערובת הטחונה, ואחריהם 100% אתנול. מהדקים את המכסה וטוחנים במשך שעתיים בקצב של 180 סיבובים לדקה.
לאסוף את ההשעיה ולהפריד את הכדורים, באמצעות 100% אתנול לשטיפה. יבש את ההשעיה בתנור ב 120 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מוסיפים את האבקה המיובשת לצנצנות הטחינה עם כדורי זירקוניה של מילימטר אחד ו-100% אתנול באותם יחסי משקל כמו בשלב הראשון.
טוחנים במשך שעתיים ב 180 סיבובים לדקה. לאחר מכן להפריד ולייבש בתנור. מוציאים את הדגימה מהתנור.
כדי ליצור את דיו העצם, להוסיף 630 מיקרוליטר של גליצרול ו 130 מיקרוליטר של polysorbate 80 לצנצנת מיל כדורית. לאחר מכן מוסיפים 100 מיליגרם של אמוניום פוספט דו-בסיסי ושני גרם אבקת אלפא-טריקלציום פוספט לתמיסה ומערבבים ברציפות עם מרית לשילוב. מוסיפים כדור זירקוניה בקוטר 25 מ"מ, מהדקים את המכסה ומניחים אותו בתוך טחנה פלנטרית למשך 60 דקות ב-180 סיבובים לדקה, תוך השהיה באמצע הדרך כדי לגרד את דפנות הצנצנת בעזרת מרית.
טען את הדיו לתוך מזרק מיליליטר אחד. צור תמיסה של 10% של ג'לטין מסוג A ב- 1X PBS כמתואר בכתב היד של הטקסט. מניחים את הבקבוקון החרוטי על המערבל.
לאחר מכן מוסיפים 5.796 מיליליטר של אנהידריד מתקרילי וממשיכים לערבב בחושך ב 50 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. להרוות את התגובה על ידי דילול התוכן החרוטי פי שניים עם PBS. התמזגו לתוך צינורות של 50 מיליליטר והסירו את האנהידריד המתקרילי שלא הופעל על ידי צנטריפוגה ב-3000 RCF בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות ואיסוף הסופרנטנט.
יש לדייק את הסופרנאטנט בתוך צינורות דיאליזה של תאית חתוכה במשקל 14 קילו-דלטון כנגד מים שעברו דה-יוניזציה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים תוך ערבוב עדין. החלף את המים שעברו דה-יוניזציה מדי יום. היכונו לאחסון על ידי שקיעה לתוך צינורות 50 מיליליטר, אבטחת המכסה והכנסתו למקרר למשך 12 שעות.
לאחר מכן להקפיא את הדגימות באמצעות חנקן נוזלי ומיד lyophilize במשך חמישה ימים במינוס 54 מעלות צלזיוס ו 0.4 מיליברס. אחסנו את הקצף המתקבל במקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לסנתז מיקרו-ג'לים של GelMA, הכינו תמיסת GelMA במשקל 10% לפי משקל ב-PBS על ידי שקילת ה-GelMA הליופילי, הוספתו לצינור עם PBS וחימום באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עד לקבלת לחות מלאה.
הוסף 37 מיליליטר שמן לכל מיליליטר אחד של תמיסת GelMA לכוס, וודא שהוא לא יותר מ-65% מלא. התקינו מערכת כפולה על פלטה חמה עם ערבוב מגנטי על ידי הנחת הכוס המכילה שמן בתוך גדולה יותר. מחממים ל-40 מעלות תוך כדי ערבוב.
טען את תמיסת GelMA לתוך מזרק והוסף אותה טיפה לתוך שמן הערבוב דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. תנו לתחליב להתאזן למשך 10 דקות. להפחית את הטמפרטורה של תחליב ל 15 מעלות צלזיוס תרמית.
ייצוב הכדורים על ידי הוספת קרח כתוש לחלל שבין שתי הכוסות. הוסיפו אצטון לתחליב GelMA המסתובב. דנטשו את תוכן הכוס לצינורות של 50 מיליליטר, תוך הקפדה לשטוף את קירות הכוס באצטון.
תן לו לנוח במשך 20 דקות כדי לאפשר מיקרו ג'לים מיובשים להתיישב לתחתית. השליכו את הסופר-נטנט ושטפו את המיקרוג'לים פעמיים באצטון. התאחדו לצינור אחד, הוסיפו אצטון וסוניק למשך 10 שניות.
שוב, לשטוף אותו עם אצטון פעמיים. יש לאחסן באצטון בטמפרטורת החדר עד להצורך בהדפסה. כדי להכין את תרחיף המיקרוג'ל של GelMA להדפסה, גיבש תמיסה של 1% משקל לפי משקל של GelMA ב-DMEM כמתואר בכתב היד של הטקסט.
מאדים את האצטון מהמיקרוג'לים המיובשים ושוקלים את האבקה המתקבלת לתוך צינור. מוסיפים אצטון ומעבירים לסביבה סטרילית. כדי ליצור את תרחיף המיקרוג'ל, יש לאדות את האצטון מהאבקה שבתוך ארון ה-biosafety.
לאחר האידוי, יש להוסיף DMEM, תמיסת 1% GelMA ב-DMEM ותמיסת ייזום של 2.5% LAP כדי להשיג חלק אריזה סופי של 30% אפשר לחות מלאה למשך 12 שעות לפחות בטמפרטורת החדר. תרבית את תאי הגזע המזנכימליים שמקורם בשומן ב-DMEM דל גלוקוז בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד למפגש. הסר את תאי הגזע המזנכימליים שמקורם בשומן מבקבוק תרבית הרקמה על ידי הסרת המדיום ושטיפה עם PBS סטרילי.
גלולו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-150 RCF בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. ספרו את התאים וחשבו לפחות 5 x 10 עד חמשת התאים עבור כל מיליליטר של מיקרו-ג'לים של GelMA. הקצה את הנפח הנדרש של מתלה התא לצינור נפרד וגלולה כפי שהודגם קודם לכן.
בזהירות להסיר supernatant ככל האפשר באמצעות פיפטה, משאיר רק את גלולת התא. הוסף את הנפח הנדרש של תרחיף מיקרוג'ל לכדור ופיפטה עדינה למעלה ולמטה כדי להבטיח חלוקה אחידה. טען את התא עמוס ההשעיה במיקרוג'ל לתוך כור באמצעות פיפטה.
באמצעות מזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט של 23 מדים, הפקידו את דיו העצם, הצליבו את מבני המיקרוג'ל של GelMA עמוסי העצמות עם מנורת UV crosslinker בגודל 405 ננומטר למשך 90 שניות. העבירו מיד את תרחיף המיקרוג'ל לצלחת באר בגודל מתאים המכילה DMEM שלם. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
החלף את מדיום התרבות לאחר 24 שעות, ולאחר מכן כל 48 עד 72 שעות לפי הצורך. דיו העצם נותח על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לקבוע את מבנה המיקרו שלו, שהראה היווצרות גביש הידרוקסיאפטיט לאחר הגדרת הדיו, הנראה במיוחד בתנאי יובש. במחקר זה, התאים עורבבו עם מיקרו-ג'לים של GelMA ונשמרו בתרבית למשך עד חמישה ימים, בין אם בתרחיף מיקרו-ג'ל בלבד או במערכת COBICS.
התאים הראו כדאיות טובה בנוכחות דיו העצם, הן ביום הראשון והן ביום החמישי, ואישרו כי תוצרי ההחלקה של הדיו לא היו מזיקים לתאים. חשוב לשלוט במהירות המיקסריג תוך סינתזה של המיקרוג'ל, שכן שינוי קל בערבוב עלול לגרום להבדלי גודל. חשוב גם להבטיח הפצה הומוגנית של התאים בתוך השעיית מיקרוג'ל.
ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כדי להדפיס בתוך מתלי מיקרוג'ל מג'לטין, המשמשים כתמיכות הקרבה, ומותירים אחריהם מבני עצם עצמאיים. אבל השימוש ב-GelMA פותח את הדרך למבנים רב-פאזיים של סיר אחד, כמו ממשקי אוסטאוכונדרל או גיד עצם.
