הדמיית ספקטרומטריה של Maldi MS היא כלי מבוסס ושימושי לזיהוי והדמיה של שפע והפצת שומנים, ללא שינוי דגימה מוגזם. היתרון העיקרי של הדמיית מאלדי הוא יכולתו לזהות את השומנים באתרם ללא התוויה, ולנתח אוכלוסייה גדולה של דגימות בו זמנית. תרגול מוביל לתוצאה מושלמת.
הקפד לתרגל היטב לפני עיבוד דגימות הניסוי האמיתיות. צמצם את זמן הכנת הדגימה והימנע מזיהום לאורך כל ההליך. כדי להתחיל, הוסף את טמפרטורת החיתוך האופטימלית, או OCT לתוך cryomold פלסטיק למחצית העומק של תבנית cryo תוך הימנעות היווצרות בועות.
השאירו את התבנית על משטח שטוח במשך מספר דקות ולאחר מכן להעביר אותו על קרח יבש. השאירו את הקריומולד שטוח על הקרח היבש ואפשרו ל-OCT ליצור משטח שטוח ואחיד. המתן עד שה-OCT יתמצק במלואו בתבנית.
השתמש בשלבי OCT הקפואים באופן מיידי, או אחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הרדמת הזבובים הבוגרים באמצעות פחמן דו חמצני, הכינו צלחת פטרי המכילה חתיכת מגבון מעבדה. השתמשו במים כדי להרטיב חלק מהמגבון כדי להפחית את החשמל הסטטי.
יש לשמור את המגבון חצי לח וחצי יבש. לאחר חיתוך ראש הזבוב תחת היקף ניתוח אחד, לאסוף ארבעה עד חמישה ראשים ולשים אותם על האזור היבש של מגבון המעבדה. קח את שלב ה-OCT מקרח יבש למיקרוסקופ שניים.
העבירו מיד את הראשים לשלב ה-OCT וסדרו אותם במהירות, מה שלוקח בערך 30 עד 60 שניות כדי למנוע התכה של OCT. השאירו כמילימטר אחד של שטח ריק סביב כל מוח זבוב כדי להבטיח תמיכה מספקת מה-OCT וארבעה עד חמישה מילימטרים של שטח ריק מקצה הבלוק כדי לספק מספיק מקום לטפל בקטע. החזירו את שלב ה-OCT לקרח היבש ותנו לו להישאר דולק במשך כשלוש דקות כדי לוודא ששלב ה-OCT יישאר קפוא ומוצק.
לאחר שכל ראשי הזבובים מיושרים, הניחו לשלב ה-OCT לשבת על קרח יבש למשך חמש עד 10 דקות נוספות. מעבירים את שלב ה-OCT מהקרח היבש למשטח שטוח ואז מוסיפים במהירות כמות גדולה של תרכובת OCT כדי לכסות את כל הדגימות ולמלא את כל הקריומולד, מה שלוקח בערך שלוש שניות. מעבירים מיד את הקריומולד בחזרה לקרח יבש ומקפיאים את כל בלוק ה-OCT המכיל את הרקמות המשובצות.
תנו לשלב ה-OCT לשבת על הקרח היבש עוד חמש עד 10 דקות. תייג את הדגימות בשולי הקריומולד ואחסן את הדגימות הקפואות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנות לחתך. אשר את הצד המקודד ITO על-ידי בדיקת המוליכות של שקופיות ITO באמצעות מד מתח המוגדר להתנגדות.
סמן את הצד במדידת התנגדות כצד שאליו יש לדבוק ברקמה. תייג אותו והגדר תמיד מגבון מעבדה בתחתית השקופית כדי למנוע זיהום שקופיות. לאחר מכן, לאפשר לרקמות להתאזן בתא cryostat במשך 30 עד 45 דקות.
נקו את הקריוסטאט, רצוי עם 70% אתנול. נגבו את צלחת הגליל בשלב והסירו את הלהבים המשומשים. השתמשו במגבונים נקיים נוספים כדי לוודא שהאתנול התאדה ושכל המשטחים יבשים לפני תחילת החתך.
לאחר מכן, התאם את הטמפרטורה של ראש דגימת החול של תא cryostat בהתאם לסוג הרקמה. הרכב את הרקמה על מחזיק הדגימה באמצעות OCT. היזהר להשתמש במספיק OCT כדי לכסות את הבסיס של בלוק OCT ולהרכיב את הבלוק שטוח ככל האפשר.
הניחו להב נקי על הבמה ונעלו אותו. מקם את ראש הדגימה לכיוון השלב לפי הצורך כדי להשיג את זווית החיתוך הרצויה. לאחר מכן מתחילים את החיתוך בקטעים עבים עד שנמצא אזור העניין.
הברישו ללא הרף את החלקים הנוספים עם מברשת אמן מקוררת מראש כדי לשמור על הבמה נקייה. כוונן מעט את טמפרטורת התא לפי הצורך ושנה את עובי המקטעים ל-10 עד 12 מיקרומטר לאחר ההגעה לאזור הרצוי. בזהירות לאסוף את החלק הרצוי.
קח שקופית ITO בטמפרטורת החדר ומקם אותה מעל הקטע. ניגשו לקטע בעדינות והדביקו אותו למגלשה מבלי להשאיר עקבות על במת הקריוסטאט. הניחו את המגלשה בצד במתלה, או נגבו במעבדה מחוץ לקריוסטאט בין האוספים של מספר חלקים.
אם יש צורך בהשוואה בין דגימות שונות מאותה קבוצה, מקם את המקטעים מדגימות מרובות בשקופית אחת, כך שניתן יהיה לנתח אותם בו-זמנית כדי למזער את השונות. במידת הצורך, יש להפריד לשתי שקופיות, שכן מחזיק היעד Maldi יכול להכיל שתי שקופיות בריצה אחת. מעבירים את השקופיות בקופסת ואקום לייבוש עם ייבוש כשכבה התחתונה.
כונן את השקופיות תחת ואקום במשך 30 עד 60 דקות, ולאחר מכן המשך לתצהיר המטריצה. יש להשתמש בשתיים חמש חומצות בנזואיות דיהידרוקסיות, או DHB, במי מתנול כמטריצה. הכניסו את השקופיות למוביל שקופיות ואטמו היטב את הפתח בעזרת סרט השעווה.
אטמו עם שקית הרוכסן. הכניסו אותו לשקית רוכסן אחרת המכילה חומר ייבוש. תייג את החלק החיצוני ושלח את הדגימה למתקני הליבה של Maldi עם עיניים יבשות מספיקות.
עבור תצהיר המטריצה, השתמש ב-40 מיליגרם למיליליטר של DHB ומי מתנול כמטריצה ורסס אותו באמצעות מרסס מטריצה HTX M5 אוטומטי. השתמש בלחץ גז חנקן של 10 PSI. השתמש בזמן טיסה מלדי, מכשיר MS ומצב יון חיובי כדי לרכוש ספקטרום מסה.
כייל את המכשיר על ידי זיהוי 0.5 מיקרוליטרים של תחליב זרחן אדום באצטו ניטרו על שקופיות ה- ITO. השתמש בספקטרום שלו כדי לכייל את המכשיר בתחום המסה של 100 עד 1000 MZ על ידי החלת עקומת כיול ריבועית. הגדר את קוטר נקודת הלייזר לבינוני מכיוון שהוא פרופיל הקרן המווסתת לרוחב רסטר של 40 מיקרומטר, ואסוף נתוני הדמיה על ידי סיכום 500 צילומים בקצב חזרה של לייזר של 1000 הרץ לכל מיקום מערך.
לאחר מכן רשום את הנתונים הספקטרליים. בצע את ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות נורמליזציה ריבועית ממוצעת של שורש כדי ליצור תמונות יונים ברוחב פס של פלוס מינוס 0.10 Dalton. יישר את הספקטרום של ה-OCT ושל רקמת המוח מאותו ניסוי באמצעות התוכנה כדי להעריך את הפסגות החופפות בהפרעות דיכוי היונים של ה-OCT.
לבסוף, לעבד את שקופיות MALDI המכילות את דגימות הרקמה על ידי המטוקסילין ואאוזין, או הכתמת H ו- E. תמונות מניתוח Maldi MS חשפו ירידה כללית בתכולת השומנים במוח המוטנטי של LPR1 נוקאאוט. מקטעי המוח של זבוב הבוגרים המוכתמים ב-H ו-E מוצגים כאן.
מיני השומנים, ערכי ה- MZ המתאימים להם ומאזני מפת החום מצוינים גם הם בתמונה זו. הקיפול הממוצע של ההפחתה במוטציית הנוקאאוט LPR1 בהשוואה לבקרות מארבעה שכפולים ביולוגיים לפחות, מוצג כמספרים ליד החצים. ספקטרום המסה של אזור ה-OCT הריק שנבחר באזור רקמת המוח, הן מהזבובים הביקורתיים והן מהזבובים המוטנטיים, מוצג בטווח של MZ1 עד 1000 ו-MZ520 עד 900.
ההפרעה של OCT קשורה הן לתופעות דיכוי יונים והן לבעיות אות חופפות. כדי לשמור על נאמנות נתוני הליפידומיה, הכנה מתאימה של דגימה, דיסקציה וחיתוך קריו הם חיוניים. לאחר ביצוע ניסוי מאלדי, ניתן לאמת את זהות השומנים באמצעות LCMS, הידוע גם בשם כרומטוגרפיה נוזלית, ליפודומטיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.
טכניקה זו משיגה תובנות מולקולריות על הומאוסטזיס של שומנים במוח על ידי שימוש במערכת המודל החזקה עד הרכה אשר סוללת את הדרך להבנת שינויים מטבוליים הקשורים למחלות אנושיות במוח.
