פרוטוקול זה מאפשר את הערכת השלמות הסינפטית בשבב של הגרביל בכל הגילאים. זה חשוב למחקר בסיסי על בעיות שמיעה, בפרט, עקב הזדקנות. הפרוטוקול מהיר יחסית ומניב נתונים כמותיים מכמה מקומות לאורך השבלול.
יתר על כן, הוא מטפל בבעיה ספציפית של רקמת הזדקנות על ידי שימוש ב- autofluorescence quencher. התנוונות של סינפסות היא הסימן המוקדם ביותר לאובדן תפקוד בשבב. כימותו הוא כלי חשוב במחקר לקראת פיתוח כלי אבחון לא פולשניים לסינפטופתיה.
דיסקציית השבלול היא החלק המכריע ביותר הדורש תרגול, ולכן עדיף להתחיל עם שבלול לא ניסיוני. התחילו בהסרת הבולה. חותכים את העצם עם מספריים או מפצחים את העצם עם מלקחיים ומסירים אותה עם מלקחיים כדי להגיע לשבבייה.
הסר את תעלות המאלאוס, האינקוס והחצי-עיגול. הסר בזהירות את העצם המכסה את פסגת השבלול ושרט את עצם השבלול עם מלקחיים כדי ליצור חורים קטנים בקצה ובפנייה הבסיסית או לתקוע בזהירות חורים בשני המקומות. מיד להעביר את bullae לתוך לפחות 50 מיליליטר של קיבוע קר.
כדי לחתוך את השבלול לשניים, יש למקם חתיכת סכין גילוח ארוכה יותר מהאורך המפותל של השבלול למחזיק להב. לאחר מכן, הניחו את השבלול בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו. חותכים עודפי רקמות עם סכין גילוח או עם מספריים עדינים.
החזיקו את השבלול במקומו עם מלקחיים עדינים וחתכו לשניים לאורך המודיולוס. הכן תמיסה של 5% של quencher autofluorescence על ידי ערבוב זה עם 70% אתנול. מניחים את השבלול בתמיסה זו ומדגרים אותו למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר ולאחר מכן שוטפים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS למשך חמש דקות.
לצורך כריתת השבלול, אספו שני מלקחיים עדינים, מלקחיים עדינים במיוחד, וואנות, מספריים קפיץ, מחזיק להב, סכין גילוח, ומלאו צלחת פוליסטירול פטרי ומכסה שלה ב-PBS. לשבור חתיכות מסכין הגילוח כדי לקבל משטח חיתוך של שניים עד ארבעה מילימטרים. חותכים את השבלול לשניים כפי שמוצג בסעיף להכנת רקמות.
בזהירות לתקן את חצי השבלול עם המלקחיים כך שקצה החתך פונה כלפי מעלה. השתמשו במספריים קפיציים עדינים כדי לחתוך את עצם השבלול מעל ההליקוטרמה המכסה את הפסגה. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לבודד את הפנייה האפית על ידי חיתוך דרך המודיולוס ועצב השמיעה וסקאלה וסקליבולי.
בצע שני חתכים בכל צד של עצם השבלול למעלה, או אם stria vascularis אינו נחוץ להערכה נוספת, ישירות דרך stria vascularis של הפנייה האמצעית. השתמש בסכין הגילוח כדי להפריד בין חלקי השבלול. לחלופין, לחתוך בין האיבר של קורטי לבין stria vascularis.
השאירו את ה-stria vascularis מחוברים לרצועה הספירלית והסירו את העצם המנופחת באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, העבירו את חלקי השבלול למכסה צלחת פטרי מלא ב-PBS. הסר רקמות עודפות על דפנות העמוד והטודיוליה כך שכל התושבות ישכבו מאוחר יותר על המגלשה שטוחה ככל האפשר.
חתיכות שבלול גדולות, במיוחד אלה שמקורן בפנייה הבסיסית, יש לחתוך לשתי חתיכות. בזהירות להסיר את קרום tectorial עם מלקחיים סופר עדינים. מניחים את חתיכות השבלול על מגלשה לתוך טיפה של מדיום הרכבה, ומבטיחים שהאיבר של קורטי פונה כלפי מעלה.
הזיזו את פיסת השבלול למישור הסגיטלי וחפשו אינוויגינציה של הלימבו הספירלי בסמיכות לתאי השערה הפנימיים. את האינווגינציה הזו של הלימבוס הספירלי ניתן לראות בצורה ברורה יותר בחלקי השבלול האמצעיים והבסיסיים. העבר את כל השבלול ואת כל הסטריה וסקולרית לשקופית המיקרוסקופ על ידי חזרה על שלבים אלה.
מכסים מחליקים את המגלשה ומוסיפים לק שחור סביב הקצוות לאיטום. יבשו בחושך ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס. פתח עותק של הערימות המפורקות בתוכנת ImageJ הטעונה בתוסף BioVoxxel.
פצל את הערוצים על-ידי לחיצה על תמונה, לאחר מכן על צבע ולאחר מכן על פיצול ערוצים. מזג אותם על-ידי לחיצה על תמונה, לאחר מכן על צבע ולאחר מכן מיזוג ערוצים כדי להקצות צבעים שונים. המר את התמונה למחסנית RGB על-ידי לחיצה על תמונה ולאחר מכן עבור אל צבע ולחץ על מחסנית ל- RGB.
התאם את הבהירות והניגודיות על-ידי לחיצה על תמונה, כוונן ולאחר מכן על בהירות/ניגודיות. השתמשו ב'אוטומטי' או ב'סליידר' כדי לוודא שהמבנים שלפני ואחרי הסינפטיה ותוויות תאי השיער הפנימיים נבדלים מהרקע. סמן חמישה תאי שיער פנימיים באמצעות כלי הטקסט על-ידי לחיצה על המיקום הרצוי בתוך הערימה.
לאחר מכן, עבור אל נתח, ולאחר מכן כלים, ובחר מנהל החזר על ההשקעה. סמן את תוויות תיבת הסימון כדי לתייג את הנקודות במספר. התקרבו לתא השיער הפנימי המעניין.
לחץ לחיצה ימנית על כלי הנקודות כדי לבחור במצב ריבוי נקודות. גלול בממד Z וספור את הסינפסות הפונקציונליות של הסרט, אשר מזוהות על-ידי סרט טרום-סינפטי בשילוב עם מדבקת גלוטמט פוסט-סינפטית. לאחר בחירת כל המבנים המעניינים, לחץ על הוסף את מנהל ההחזר על ההשקעה ולאחר מכן לחץ על השם השרירותי ובחר שנה שם.
בעזרת כלי היד, התאם את התמונה כך שתציג באופן מלא את תא השיער הפנימי הבא. שנה מכלי ריבוי נקודות לכלי נקודה כדי להימנע מהוספת פונקטה נוספת לנתונים שאוחסנו בעבר. לחץ על מבנה מעניין בתוך תא השיער הפנימי הבא ושנה לכלי Multi-point.
המשך להוסיף את סינפסת הסרט הפונקציונלית במנהל ההחזר על ההשקעה עד שכל תאי השיער הפנימיים יוערכו. לחץ על ערכת נתונים במנהל ההחזר על ההשקעה ולאחר מכן על מדידה. המתן להופעת חלון חדש המפרט את נקודות הנתונים שנמדדו ולחץ על קובץ ושמור בשם כדי לשמור רשימה זו כגיליון אלקטרוני.
שמור את התמונה על-ידי הפעלת 'הצג הכל' במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על Flatten כדי להוסיף לצמיתות את תוויות הנקודות לערימה ולחץ על הסכימו לסגור על ידי שמירת השינויים. הקרנות של מחסנית Z מהשבלול של גרביל צעיר בן 10 חודשים מראות שתאי השיער הפנימיים המסומנים במיוזין 7A המתוארים כאן בקווים מקווקווים לבנים היו בניגוד חד לרקע.
הסרטים הטרום-סינפטיים סומנו ב-anti-CtBP2 שניים שהוצגו בירוק, ואילו טלאי הגלוטמט הפוסט-סינפטיים סומנו באנטי-גלו-גלו-2 המוצג באדום. השבלול מגרביל זקן בן 38 חודשים טופל בקוונצ'ר האוטופלואורסצנטי והראה תאי שערה פנימיים מובחנים עם מבנים ברורים לפני ואחרי הסינפטיה. כדי לבחון את יציבות האימונו-לבל, אותה פיסת שבלול מהגרביל הצעיר צולמה לאחר שלושה חודשים ו-29 וחצי חודשים.
למרות יחס האות לרעש המופחת, הסינפסות הפונקציונליות היו נבדלות וניתנות לכימות. גם אם חתך נכשל, הרכיבו את פיסת הרקמה הנותרת כדי להעריך מאוחר יותר את אורך השבלול המלא בצורה המדויקת ביותר. הנתונים מפרוטוקול זה הם בעלי ערך רב במיוחד אם הם קודמים לבדיקות שמיעה אלקטרופיזיולוגיות או פסיכופיזיות, ולאחר מכן מתואמות בנפרד עםן.
