פרוטוקול זה מאפשר הערכה של תפקוד המיטוכונדריה בתוך העצב על ידי פירוק המיטוכונדריה המבודדת, הליך מאתגר ברקמה קטנה המכילה מספר מוגבל של מיטוכונדריה. הטכניקה מספקת אפשרות לנתח פונקציות מיטוכונדריה כגון צריכת חמצן וייצור ROS בו זמנית במיטוכונדריה משומרת באתרה. עם מספר רב של מצעים, מעכבים ופרוטוקולי תכנון uncoupler.
מספר מחלות חולקות תפקוד מיטוכונדריאלי, במיוחד נוירופתיות המושרות על ידי סוכרת מסוג שתיים או כימותרפיה. במחלות אלה, ליקויים של זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי הם הסימן היחיד המכתיב את התפתחות המחלה. שיטה זו מספקת תובנות על נוירוביולוגיה, ביוכימיה ופרמקולוגיה, עם חקירת מנגנוני מחלות מיטוכונדריאליות, חיפוש אחר טיפולים, כגון מאיצים מיטוכונדריאליים או כאב נוירופתי.
כדי להתחיל, כייל את חיישני החמצן על ידי צנרת 2.1 מיליליטרים של מאגר MR לכל תא. סגרו אותו עם הפקקים ומשכו אוויר לתוך התא עד שנוצרת בועה. יש לערבב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת במצב כיול עד ששטף החמצן למסה מתייצב.
באמצעות תוכנת HRR לבצע כיול אוויר של חיישני החמצן הקוטבוגרפיים על פי הוראות היצרן. להכנת רקמות, מניחים את העצב הסיאטי בצלחת פטרי עם מספיק חיץ TP כדי לכסות אותו. להחזיק קצה אחד של העצב עם מלקחיים ועם זוג מלקחיים אחר למשוך את צרורות העצבים אופקית.
ראשית, להעביר את הרקמה המוצגת לתוך צלחת קטנה המכילה מאגר TP מיליליטר אחד עבור חדירת רקמות. כדי להתחיל permeabilization, להעביר את הרקמה עם מלקחיים למנה אחרת המכילה מיליליטר אחד של חיץ TP, המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר של סאפונין. מניחים את הצלחת בשייקר מיקרו-פלטה ונותנים לה לערבב בעדינות במשך 30 דקות.
לאחר מכן, מעבירים את הרקמה עם המלקחיים למנה טרייה המכילה מאגר MR מיליליטר אחד, ותנו לה לערבב בעדינות במשך 10 דקות. העבר את הרקמה עם מלקחיים לתא HRR מכויל. מלאו את תאי ה-HRR ב-2.1 מיליליטרים של מאגר MR.
הוסף את Amplex Red ו peroxidase לריכוז סופי של חמישה מיקרומולאר, ושתי יחידות לכל מיליליטר, בהתאמה. לאחר מכן, הוסף את העצב הסיאטי החדיר. חברו את החיישנים הפלואורסצנטיים של המכשיר.
לאחר מכן, כבה את האורות בחלק הבקרה של התוכנה ולחץ על התחבר לאוקסיגרם "עבור לערוך פרוטוקולים" בתוכנה והכנס את משקל הרקמה. עבור אל הפריסה ובחר את האפשרות הספציפית של שטף ליחידת דגימה." לאחר מכן בחר מגרשים כדי לגשת בו זמנית לקריאת צריכת החמצן, ובמידת הצורך, לייצור מי חמצן.
המתן כ- 10 דקות. להזריק שני פולסים של מי חמצן, כל אחד לריכוז סופי של 260 מיקרומולר לכיול החדר. הזריקו 20 מיקרוליטרים של סוקינט, מצע קומפלקס מיטוכונדריאלי II, כדי להפעיל את מערכת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית.
הוסף 20 מיקרוליטרים של ADP כדי להפעיל סינתזת ATP. ברצף, הוסף חמישה מיקרוליטרים של ציטוכרום c כאינדיקטור לשלמות הממברנה. Titrate עם aliquots של 0.2 מיקרוגרם לכל מיליליטר של אוליגומיצין עד שלא נצפתה ירידה נוספת בצריכת החמצן.
Titrate עם aliquots של 0.5 micromoles לליטר FCCP, uncoupler המיטוכונדריה, עד לא נצפתה עלייה נוספת בצריכת החמצן. כדי לסיים את הניסוי להזריק שני מיקרוליטרים של אנטימיצין A, לעשות ריכוז סופי של חמישה מילימולר ולחכות שהזרימה תתייצב. עבור אל שורת הפקודות.
חפש רב-חושי"בתוכנה. לחץ על פקד "ואז לחץ על שמור קובץ" והתנתק. פתח את הקובץ שנשמר ובחר את שטף החמצן לכל מגשי מסה כדי לקבל את תוצאות צריכת החמצן הניסיונית.
בחר באופן ידני את החלון בין הזרקות על ידי לחיצה על לחצן Shift בתוספת העכבר השמאלי. עבור אל סימנים, ובחר נתונים סטטיסטיים כדי להמחיש את התוצאות עבור כל זריקה של מצעים, מעכבים ופרוטוקול uncoupler. עבור ייצור מי חמצן לבצע את אותו הליך עם עקבות שיפוע המגבר.
הירידה בפוטנציאל הממברנה שמקודמת על ידי פעילות הסיתאז ATP האיצה את צריכת החמצן. התוספת של ציטוכרום C אקסוגני קידמה רק גירוי מינימלי של הנשימה, ואישרה את שלמות הממברנה החיצונית המיטוכונדרית להכנה זו. זרמי חמצן מוחלטים נרשמו ורק עלייה של 6.3% נצפתה בנשימה, מה שמעיד על איכות טובה של הכנת הרקמה.
צריכת החמצן וייצור ה-ROS נמדדו בו זמנית בנוכחות מצעים שונים המספקים דלק למערכת הובלת האלקטרונים. התוספת של פירובט ומלט לקומפלקס המיטוכונדריה הגבירה את הנשימה. ותוספת נוספת של סוקסינט לקומפלקס II גם מגדילה את צריכת החמצן.
לכן ניתן היה לבדוק מצעים אחרים. גם ייצור ה-ROS גדל, מה שמעיד על דליפת חמצן ממערכת הובלת האלקטרונים. תוספת של אדנוזין דיפוספט בריכוז רוויה הגדילה את צריכת החמצן והניעה את היווצרות ה-ATP, והפחיתה את ייצור ה-ROS.
לעומת זאת, אוליגו טיטרציה הפחיתה את צריכת החמצן והגבירה את ייצור ה-ROS. זה הציע כי עצב סיאטי מחלחל יכול לשכפל את הקשר הסטנדרטי בפיזיולוגיה המיטוכונדרית. התוספת של FCCP ורטינון, התואמת את השינויים הצפויים בשטף החמצן, מאשרת כי הפיזיולוגיה המיטוכונדרית והפרופיל הביו-אנרגטי נשמרו בעצב הסיאטי המחלחל.
הצעד החשוב ביותר הוא להכין בעדינות את חלק הרקמה, לוודא שכל פתחי התאים מנוקים כראוי. שינויים בתפקוד המיטוכונדריה יכולים לנבוע מתפקוד לקוי או ממספר מיטוכונדריאלי נמוך יותר. לכן פעילות סינתאז מצוטטת ואישור תכולת דנ"א מיטוכונדריאלי על ידי PCR מומלצים.
