שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בטיפול של microRNA לכליה, אשר נשאר אתגר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת טיפול במיקרו-רנ"א המחקה את הכליה מבלי לגרום לתגובת אינטרפרון או לחוסר יציבות גנטית. התחל על ידי המסת 10 מיקרוליטר של PEI-NPs ב 90 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז 5% בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה. ערבבו 50 מיקרוליטר של miRNA מסונתז באופן מלאכותי המומס ב-100 מיקרומולר של מים נטולי נוקלאז עם 50 מיקרומולר של תמיסת גלוקוז 10% בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מיליליטר. מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.
תהליך זה מניב miRNA מומס בתמיסת גלוקוז 5%. לאחר מכן ערבבו 100 מיקרוליטר של PEI-NPs בתמיסת גלוקוז 5% ו-100 מיקרוליטר של miRNA בחיקוי בתמיסת 5% גלוקוז. מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.
דוגרים על התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין קומפלקס יציב של חיקוי miRNA מסוג PEI-NPs. להמיס שני מיקרוליטרים של PEI-NPs ב-98 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז 10% בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מערבלים את הצינור בעדינות ומסתובבים כלפי מטה.
לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של miRNA המסומן Cy3 מחקה ל -100 מיקרוליטר של PEI-NPs בתמיסת גלוקוז 10% ומערבל את הצינור בעדינות. לדגור על התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכין קומפלקס יציב של PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimi. הניחו את עכבר ה-UUO בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר ללא הרדמה ולאחר מכן הניחו את הזנב דרך חור מוכן בפקק.
ממלאים מזרק של מיליליטר אחד במחט של 30 מד עם 200 מיקרוליטר של קומפלקס PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-מחקה והזריקו את הקומפלקס דרך וריד הזנב של העכבר. לאחר מכן, בצע חתך לתוך העור, השרירים והצלעות עם מספריים כירורגיים ומלקחיים כדי לחשוף את הלב. לאחר ביצוע חתך באטריום הימני, יש להזריק PBS לחדר השמאלי עד שצבע הכליה משתנה לצהוב חיוור.
זה מצביע על כך שכל גוף העכבר מחורר עם PBS. לאחר איסוף הכליות, להסיר את כמוסות הכליה, ולשטוף אותם פעמיים עם PBS. הטמיעו את דגימות רקמת הכליה בתרכובת OCT והקפיאו אותן בחנקן נוזלי.
השתמשו בהקפאה להכנת מקטעים והרכיבו את המקטעים על מגלשות זכוכית מצופות סילאן. תקן אותם עם 4% paraformaldehyde ושטוף בעדינות את המגלשות פעמיים עם PBS. לבסוף, דמיינו את הצביעה הפלואורסצנטית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 100x ו-400x ותוכנת הדמיה מתאימה.
התמונה המייצגת מציגה את המבנה של קומפלקס PEI-NPs-miRNA-mimic. ההעברה וההשפעות של miRNA-146a-5p-mimic באמצעות PEI-NPs בפיברוזיס כלייתי מתוארים בתמונות אלה. ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי הראה כי הזרקת PEI-NPs ווריד זנב יכולה לספק את חיקוי miRNA לחלל tubulointerstitial.
בעכברי פיברוזיס כליות המיוצרים על ידי UUO, זה כלל תאים צינוריים הכליה שאין להם צורה קבועה בכליה ובגלומרולוס. ניתוח qRT-PCR הראה כי הזרקה של PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic גרמה לביטוי יתר משמעותי של miRNA-146a-5p בכליה. הניתוח ההיסטולוגי עם צביעה אדומה של סיריוס מוצג כאן.
ניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הראה כי הזרקת PEI-NPs מווריד הזנב יכולה לספק חיקוי miRNA לחלל הגלומרולוס והטובולואינטרסטיציאלי בכליות של עכברי מודל כליות סוכרתיים in vivo. בנוסף, ניתוח qRT-PCR הראה כי הזרקת PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic גרמה לביטוי יתר משמעותי של miRNA-181b-5p בכליה. ניתוח היסטולוגי עם צביעת חומצה שיף תקופתית הראה כי הזרקה של PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic פעם בשבוע מגיל 10 עד 20 שבועות עיכבה את התקדמות מחלת כליות סוכרתית בעכברים.
העברה והשפעות של PEI-NPs-miRNA-5100-mimic בעכברי מודל של פגיעה חריפה בכליות המיוצרים על ידי פגיעה בזילוח איסכמיה מוצגים כאן. הנתונים של ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי qRT-PCR ניתוח כדי להעריך את השפעות ביטוי היתר של miRNA-5100 לאחר הזרקת PEI-NPs-miRNA-5100-mimic ואת הניתוח ההיסטולוגי של כליה מוכתמת hematoxylin-eosin מתוארים בתמונות אלה. PEI-NPs המוזרקים דרך וריד הזנב יומיים לפני הפגיעה באיסכמיה, או IRI, מונעים התקדמות פגיעה חריפה בכליות הנגרמת על ידי IRI.
בעת ביצוע טכניקה זו, להכין חלקים בעובי חמישה מיקרומטר הכוללים רקמת כליה רבה ככל האפשר. אתה יכול גם להכין חלקים בעובי שבעה מיקרומטר.
