כאן הדגמנו את הפרוטוקול להשגת ושימור התאים הטובים והברי קיימא לשימושים בצעדים טיפוליים, כמו עירוי של תאים מזנכימליים פלוריפוטנטיים. היתרון העיקרי של זה, כי באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים להשיג את נפח התא קיימא לעומת הזמן שנצבר בשלב הבידוד של התאים מן הרקמה שנאספה. טכניקה זו יכולה להיות מורחבת לכל מחלה או מצבים שבהם מיושמים רפואה הטרוגנית וטיפול תאי.
ניתן ליישם שיטה זו גם על בדיקות יציבות ציטוגנומיות בתחומים כגון בדיקות סמים, שם ניתן לעודד תרביות תאים ארוכות טווח. בכל פעם מניפולציה של תאים חיים, להיות רגוע ובטוח. קח זהירות רבה עם אלח דם ולהיות ערני כל הזמן עם העיניים של המדען כדי לבחון כל מצוקה ולקבל החלטות טובות.
התחל על ידי שקילת השקית ומדידת הטמפרטורה באמצעות מדחום קליני דיגיטלי ללא מגע אינפרא אדום. השאירו את השקית במשך חמש דקות בתוך תא הזרימה הלמינרית כדי לזרז את השכבות השמנוניות יותר ולהפריד את הרקמה המכילה את התאים. להזריק 100 מיליליטר של DPBS עם סידן לתוך שקית ההעברה ומערבבים אותו עם הידיים.
תן לזה לעמוד במשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש במזרק של 60 מיליליטר המחובר למתאם השקית כדי להשליך את רוב הנוזל הבסיסי שמזרז. חזור על תהליך זה פעמיים.
מוסיפים 100 מיליליטר של תמיסת העיכול לשקית, ומשאירים אותה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות תחת ערבוב איטי. לאחר מכן מעבירים את כל תכולת השקית לארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגות ב-400G למשך 10 דקות ב-22 מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופר-נטנט ולהוסיף 5 מיליליטר של DMEM עם גלוקוז נמוך בתוספת 20% סרום בקר עוברי לכדור התא.
יש לערבב תמיסה טרייה של 10 מיקרוליטרים של טריפאן כחול ב-0.05% במים מזוקקים עם 10 מיקרוליטרים של תרחיף תאי למשך חמש דקות. השתמש במיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של פי 20 וספור את התאים בני הקיימא בתא ספירת תאי נויבאואר. להשעות את כדור התא במדיום מגן קריו בריכוז של 1 מיליון תאים למיליליטר.
ואז במקום 1 מיליליטר של תערובת זו בקבוקונים cryo. השתמשו במיכל הקפאה עם קצב קירור של 1 מעלות צלזיוס לדקה ואחסנו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שנה. לאחר שנה, אחסנו אותו בקופסאות קלטות סטנדרטיות שקועות בשלב אדי חנקן נוזלי.
בטבלה זו מוצגים נתונים משלבים שונים של ההליך מתשעת החולים. על פי התפוקה התאית הראשונית, נקבע נפח משתנה של תאים עבור כל דגימה. 1 מיליליטר של דגימות עם תפוקה תאית גבוהה יותר, 1.1 מיליליטר עבור דגימות עם תפוקה תאית בינונית ו-2 מיליליטר לכל דגימה עם תפוקה תאית נמוכה יותר.
התפוקה התאית לפני מעבר אחד השתנתה באופן נרחב גם כאשר נצפה אותו מפגש לפני טריפסיניזציה. לכן, כאן התאים עשויים לגדול בשכבות. התמונה המייצגת מציגה את ה- ADSCs המזנכימליים הדבקים בפלסטיק במעבר הראשון לאחר בידוד במיקרוסקופיית אור.
התאים מראים הידבקות למורפולוגיה דמוית פלסטיק ופיברובלסט. התאים בני הקיימא שנספרו בתא נויבאואר במבחן כחול טריפאן מוצגים כאן. נתוני ציטומטריה של זרימה משישה חולים מוצגים בטבלה זו.
מתוך תאים שליליים אלה של CD45, נקבע אחוז ה- ADSCs עם שילובים שונים של סמני תאי גזע. התמונות המייצגות מראות את תת-האוכלוסייה של תאים חיוביים עבור סמנים הקשורים לתאי גזע ב- SVF של מקרה תשע לאחר שמונה חודשים של שימור קריו. כאן, R1 הוא האזור התאי הכולל שנותח בעלילת הפיזור הקדמית לעומת הפיזור הצדדי.
ו- R2 הוא האזור השלילי CD45. אוכלוסיות CD73, CD90 ו- CD105 חיוביות באזור זה. הבחנה ADSC בכונדרוציטים, אוסטאוציטים ואדיפוציטים מוצגת כאן.
בעת ניסיון הליך זה, זכור לערבב לאט, רצוי עם הידיים, תוך השארת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לבחון את הידבקויות שלפוחיות. שמרו על טמפרטורת חדר העבודה סביב 25 מעלות צלזיוס, והימנעו מכל הלם תרמי בטמפרטורות גדולות בהרבה. הטכניקה שהראינו כאן יכולה לשמש כדי לבודד בהצלחה את התאים המזנכימליים פלוריפוטנטיים מרקמות אחרות.
