מטרת הליך זה היא לקבוע את ייצור הגלוקוז בכבד בתסמונת השחלות הפוליטיות, או במודל העכבר PCOS. חילוף החומרים של גלוקוז Dysregulated הוא ביטוי חשוב של PCOS והוא המפתח לפתוגנזה שלה. לכן, מחקרים מעורבים הערכה של חילוף החומרים גלוקוז ב- PCOS הם בעלי חשיבות עליונה.
במחקר זה, אנו דנים בהוראות שלב אחר שלב לכימות קצב ייצור הגלוקוז בכבד במודל עכבר PCOS על ידי מדידת M ועוד שתי העשרה של שישה גלוקוז דויטוש, מעקב גלוקוז איזוטופי יציב, באמצעות כרומטוגרפיה של גז, ספקטרומטריית מסה, או GCMS. הליך זה של כרוך ביצירת פתרון מעקב איזוטופי יציב, שימוש במיקום צנתר וריד הזנב ועירוי של נותב גלוקוז הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז באותו עכבר במקביל. יום אחד לפני ההליך, להכין את מאתר גלוקוז איזוטופ יציב מלוחים רגילים.
לניסוי זה נמדד ייצור גלוקוז במהלך הצום בתנאים עשירים בגלוקוז ולכן איזוטופ הגלוקוז הוכן בשתי תכשירים שונים. העוקב הוכן בתנאים סטריליים על ידי המסת סטרילית ונגירת פירוגן שישה גלוקוז מפורגן ופתרון סטרילי של 0.9% נתרן כלורי עם או בלי גלוקוז. ההטמט הראשון הוכן רק עם הנותב.
האינפוזאט השני הכיל גם את העוקב וגם את הגלוקוז הלא-איזוטופי. ברגע שהפתרונות הוכנו, הם היו סטריליים מסוננים עם מסנן 0.22 מיקרון ומאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס. הפתרונות הוכנו באופן כזה שמינון ההחדרה הסופי היה קרוב למיליגרם אחד לקילוגרם ודקה ושני מיליגרם לקילוגרם ודקה בהתאמה.
למדידת שיעור הופעת הגלוקוז במהלך מצב בסיסי במצב עשיר בגלוקוז, נעשה שימוש בעירוי קבוע ממוצע של שישה 6 גלוקוז מפוברק ב-1.08 מיליגרם לקילוגרם ודקה ו-1.9 מיליגרם לק"ג בדקה בהתאמה. על מנת לחקות את מצב הפד, השתמשנו בשיעור עירוי D-גלוקוז ממוצע של 18.8 מיליגרם לקילוגרם ודקה במהלך מצב עשיר בגלוקוז. מוציאים את העכברים מכלובי הבית שלהם, ומניחים אותם בכלובי הצום שלהם שלוש שעות לפני תחילת הניסוי.
לניסוי זה, השתמשנו בעכברות בנות ארבעה חודשים מזן C57BL6J. להרכיב את ציוד caging על ידי קיבוץ העכברים למספר מוגדר של עכברים לכל משאבת אינסולין. מניחים מחיצות על בסיס שטוח ויציב כדי ליצור דוכנים בודדים לעכברים.
הכלובים נקיים ועשויים מפלקסיגלס. יש בסיס שטוח ויציב שעליו יושבות המחיצות. הדלת לכלוב מחליקה להיסגר ויש לה חריץ בתחתית כדי לאפשר לזנב להיכנס.
להרכיב את המזרקים המכילים מיליליטר אחד של אינפוסאט בזאלי, ולאחר מכן להתחבר צינורות משאבת עירוי באמצעות צינורות פוליאתילן. הכן את משאבת העירוי על ידי הגדרת הקצב ל 150 microliters לשעה, שהוא קצב הבסיס. מחממים אמבט מים ל-48 מעלות צלזיוס.
הכן את תחנת החדרת הצנתר הסמוכה לאמבט המים המכילה את מחטי 30 מד חצי אינץ ', צינורות סילאסטיים, וקלטת הובלה באורך אינץ '. בחר עכבר אחד והצב אותו במחזיק מאובטח עם גישה לזנב. מניחים פיסת סרט על החלק הפרוקסימלי של הזנב כדי לאפשר מקום להכנסת הצנתר בצורה מרוקנת יותר.
להביא את העכבר לאמבט המים, ולהכניס את הזנב באמבט המים במשך כ 30 עד 45 שניות. זה עוזר להרחיב את כלי הזנב עבור מיקום קטטר. החדרת הצנתר חייבת להיעשות בתנאים סטריליים.
לאחר שהזנב מתחמם, נקו את הזנב, והנחו מהדק תנין קטן ללא שיניים מנחושת כחוסם עורקים בקצה הפרוקסימלי של הזנב. דמיינו את וריד הזנב לרוחב תחת זכוכית מגדלת. לאחר מכן, בזהירות להכניס את הקטטר לתוך הווריד הזנב, לשטוף את הפתרון בעדינות כדי להבטיח patency של הקטטר.
עטפו פיסת סרט תובלה סביב אתר ההחדרה כדי לאבטח את הקטטר, והסירו את חוסם העורקים הקטן מהזנב. מניחים את העכבר בכלוב הבודד שלו וסוגרים את דלת ההזזה, ומבטיחים שהזנב יתבלט דרך החריץ ויישאר מחוץ לכלוב. מניחים פיסת סרט נוספת על כל הקטטר והזנב כדי לאבטח אותו ללוח הבסיס של הכלוב.
נתק את הסומק מצנתר הוורידים האחוריים, והנח את המלחציים הקטנים על הצינור הסילאסטי של הצנתר כדי למנוע זרימה אחורית תוך חיבור קו ההחדרה מהמשאבה. לאחר חיבור מאובטח, להסיר את המהדק לשטוף את פתרון priming אשר מורכב infusate. ודא כי הפתרון ברור בצינור ולא מוכתם בדם.
לאחר קווי עירוי הם ציינו לתפקד כראוי, להסיר את הכיסוי מן העכבר. מקם מצעים סטנדרטיים סביב העכבר. התחל את עירוי עם infusate המכיל את המעקב, ולהפעיל אותו במשך שלוש שעות ברציפות.
למשך העירוי, להמשיך לבדוק את רווחת העכברים, כמו גם את קווי עירוי. ודא כי צינורות עירוי מאובטח כראוי וכי אין דליפות מנקודות החיבור של הקו. לאחר העירוי הראשון הושלם, לעצור את עירוי ולהניח מלחציים על צינורות של הצנתר כדי למנוע זרימה אחורית.
הסירו בעדינות את העכברים מהמתחמים שלהם מבלי להפריע לצנתר כדי לאסוף דם. לניסוי זה, העכברים עברו ניקוב וריד הלחי באמצעות רומח ארבעה מילימטר. לאסוף כ 75 microliters של דם לתוך המשחקון הרצוי שלך.
כדי deproteinize דגימות כהכנה ספקטרומטריית מסה, להוסיף כ 15 microliters של דם ל 500 microliters של אצטון. ניתן להשתמש בדם הנותר כדי לבדוק את רמת הגלוקוז בדם באמצעות גלוקומטר ו/או צנטריפוגה כדי להפריד פלזמה לבדיקות הורמונים עתידיות. הסר את infusate מן משאבות המזרק על ידי ניתוק הצינורות מן המזרקים, ולהחליף אותו עם infusate השני המכיל נותב יחד עם גלוקוז.
חזור על שלבי עירוי קודמים באמצעות עירוי גלוקוז איזוטופי עשיר גלוקוז. כדי להגיע למצב יציב, הפעל בולוס של החדירה השנייה ב 600 מיקרוליטרים לשעה במשך 15 דקות. שים לב לזמן ההתחלה עבור כל קבוצה של כלובים.
להקטין את שיעור עירוי ל 150 microliters לשעה כדי להשלים את שלוש שעות של זמן עירוי הכולל. דגימת דם חוזרת כפי שתואר בעבר. לנתק חליטות, להפעיל לחץ באתרי הצנתר עד הדימום מפסיק, ולהחזיר את העכברים לכלובים הביתיים שלהם.
לאחר מכן, הדגימות נשלחות עבור GCMS. חשב את ההעשרה האיזוטופית של איזוטופ גלוקוז תחת שיא גלוקוז על ידי GCCMS באמצעות נגזרת פנטאצטאט. בקצרה, שיטה זו כרוכה בהכנת נגזרת המחומש של גלוקוז, ואחריה ניתוח מדגם באמצעות GCMS במצב יינון כימי חיובי.
ניטור יון סלקטיבי של יחס המסה לטעינה, 171 עד 169, מבוצע כדי לקבוע את M ועוד שתי העשרה של איזוטופ גלוקוז. כל המדידות הקינטיות מבוצעות בתנאי מצב יציבים. חשב את קצב המראה הכולל של גלוקוז פלזמה מ M ועוד שני העשרה של איזוטופ גלוקוז ופלזמה באמצעות משוואות דילול איזוטופ הוקמה.
בתנאי מצב יציבים, ההנחה היא כי שיעור המראה של גלוקוז שווה לקצב היעלמות הגלוקוז. קצב ייצור הגלוקוז האדוגוגני שווה לשיעור הגלוקוז הכולל בפלזמה פחות גלוקוז אקסוגני. טבלה 1 כוללת את התוצאות הייצוגיות מהמחקר.
כל היחידות מתבטאות כמיליגרם לקילוגרם ודקה. באמצעות משוואות דילול איזוטופ שתוארו בעבר, חושב שיעור הגלוקוז הכולל של הפלזמה. בקבוצת הביקורת, שיעור הגלוקוז הממוצע של המראה היה 19.98 במצב הצום.
בתנאים עשירים בגלוקוז, שיעור הגלוקוז של המראה היה 25.8. קצב ייצור הגלוקוז היה 19.08 במצב הצום ו-8.56 במצב העשיר בגלוקוז. חילוף חומרים חריג של גלוקוז והומיוסטזיס נפוצים ב-PCOS.
בהפרעות של חילוף חומרים חריג של גלוקוז, ויסות של דיכוי ייצור גלוקוז נפגעת המובילה להיפרגליקמיה. במחקר זה, אנו מתארים דרך פשוטה למדוד את קצב ייצור הגלוקוז בכבד בעכברים מרובים בו זמנית. המרכיבים הקריטיים של ניסוי זה הם החדרת קטטר והגדרת המדידות המדויקות של איזוטופ הגלוקוז והגלוקוז הטבעי על מנת לבצע כראוי GCMS.
היתרונות של המחקר הוא השגת עירוי בצורה זעיר פולשנית עקב החדרת צנתר וריד הזנב, כמו גם שימוש במעקב גלוקוז קל להשגה ויציב. ישנן כמה מגבלות למחקר, כולל הדרישה הטכנית של ההליך והצורך בכישורים נוספים אפשריים. בסך הכל, אנו מתארים דרך פשוטה ומדויקת למדוד את קצב ייצור הגלוקוז הכולל בכבד במודל עכבר PCOS.
טכניקה זו יכולה לשמש כבסיס למחקרים מרובים מעורבים חילוף החומרים גלוקוז של מודלים עכבר.
