כדורי גידול תלת-ממדי החליפו את טכניקת המונו-שכבתית הדו-ממדית הקונבנציונלית כסטנדרט הזהב לחקר סרטן במבחנה. מודלים אלה מאפשרים את התרבות המשותפת של סוגי תאים מרובים המשקפים את ההטרוגניות של מיקרו-סביבה הגידול ומאפשרים ניצול של אינטראקציות מרחביות. היתרונות של שימוש בשיטת טיפות תלויות כדי ליצור כדורי תלת-ממד הוא היעדר אינטראקציה בין תאים לפלסטיק וקלות לימוד האינטראקציה בין תאי הגידול לתאים שאינם סרטניים.
טכניקה זו מספקת גם דרך לשחזור וחסכוני למודל אינטראקציה סרטומלית-גידול. גידולים תלת-ממדיים הם מודלים פרה-אקליניים בעלי ערך ומשמשים לעתים קרובות ככלי הקרנת סמים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את ההשפעות הפרמקולוגיות של תרכובות מרובות על צמיחת הגידול ואת microenvironment שמסביב.
תהליך היווצרות כדורי הוא ידידותי למשתמש ודורש ציוד מעבדת תרבות תאים קונבנציונאלי. ניתן לדמיין כדורי ספירואידים באמצעות כל מיקרוסקופ אור הפוך עליון, וניתוח גודל וצורה של כדוריים יכול להתבצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מקוונת הזמינה באופן נרחב. כדי להתחיל, להסיר את קווי תאי הגידול של Huh7 ו- Hep3B HCC ואת קווי התאים פיברובלסט COS-7 ו- LX2 ממתלה האחסון שלהם בחנקן נוזלי ולהפשיר אותם במהירות.
לאחר הפשרה, לדלל את התאים המופשרים עם שני מיליליטר של מדיום תרבית טרי. צנטריפוגות התאים. השליכו את הסופר-נט וחידשו את גלולה התא במיליליטר אחד של מדיום תרבות חם ורענן.
לאחר מכן זרעו את התאים בבקבוקי תרבית התא T75 ודגרו אותם באינקובטור תרבית תאים עד שתאים מגיעים ל-60 עד 70 ומפגש. עבור איסוף תאים, שאפו את מדיית התרבות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן כדי לנתק את התאים החסידים מתחתית הבקבוקונים, להוסיף שני מיליליטר של טריפסין התחמם מראש ודגורה ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר ארבע דקות, לנטרל את טריפסין על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות מלאה ולאסוף את השעיית התא, ואז צנטריפוגות התאים ולהשליך את supernatant לפני שימוש חוזר התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי. לבסוף, להוסיף שלושה מיליליטר נוספים של מדיום תרבות טרי. כדי לספור את התאים, מערבולת בעדינות את השעיית התא.
לאחר מכן באמצעות פיפטה 10 microliter, לערבב 10 microliters של השעיית התא עם 10 microliters של כחול טריפן בעדינות pipette התערובת למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי להבטיח הכתמה מלאה של פני התא החיצוני עם הצבע. לאחר מכן, מניחים כיסוי מעל אזור הספירה של ההמוציטומטר. לאחר מכן מניחים את קצה הפיפטה המכיל את תערובת התאים ליד קצה כיסוי הכיסוי ומסלקים בעדינות את תוכן הקצה לשקופית הספירה.
לאחר המתנה של כמה דקות עד שההתרפסות תתיישב, תקן את ההמוציטומטר בשלב המיקרוסקופ וספור את התאים החופפים לפסיקה העליונה או הימנית תוך הימנעות מאלה החופפים לפסיקה התחתונה או השמאלית. לבסוף, חשב את המספר הכולל של תאים באמצעות נוסחה זו. לאחר שאיפת המדיום התרבותי, לשטוף את תאי LX2 שלוש פעמים עם PBS.
לנתק את התאים באמצעות טריפסין כפי שהודגם בעבר צנטריפוגות אותם. לאחר ספירת התאים כפי שהודגם בעבר, זרע פעם אחת 10 עד 10 לתאי LX2 השישי ב 10 מנות סנטימטר מעוקב ודגורה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות, לאסוף את בינוני מותנה פיברובלסט צנטריפוגה כדי כדורי כל תאים צפים.
מסנן לעקר את המדיום המותנה באמצעות מסנן 0.22 מיקרון מחובר מזרק 20 מיליליטר. ואז aliquot המדיה לתוך שני צינורות מיליליטר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. הוסף 10 מיליליטר של PBS סטרילי לתחתית צלחת 10 ס"מ מעוקב כדי לספק תנאים לחים עבור כדורי.
לאחר מכן להשעות 1, 500 תאי HuH7 HCC עם 1, 500 תאי פיברובלסט יונק COS-7 בטיפות תלויות כדי ליצור כדורים. הפוך את המכסה של המנה כדי לאפשר לתקשורת, כולל השעיית תא, לתלות מעל סביבה לחה. לאחר שלושה ימים, כדי לצלם את כדורי, לשים את המנה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ולהתאים את ההגדלה לחמש פעמים.
לאחר מכן, פתח את תוכנת המיקרוסקופ במחשב המצורף והתאם את המיקוד שלו כך שתהיה לו תמונה ברורה של כל כדורי. לאחר מכן השתמש בכלי ההצמדה בתוכנת המיקרוסקופ כדי להשיג את התמונות ולשמור את התמונות שנרכשו. מוסיפים 10 מיליליטר של PBS סטרילי לתחתית צלחת 10 ס"מ מעוקב.
לאחר מכן להשעות 3,000 תאי HCC Hep3B בטיפות התלויות כדי ליצור כדורים והפוך את המכסה של המנה המאפשר טיפות לתלות מעל סביבה לחה במשך שלושה ימים. לאחר מכן, העבר את כדורי ההפ3B ל-20 מיקרוליטרים של מדיה טרייה מתאי LX2 בטיפות תלויות. לאחר מכן הפוך את המכסה של המנה שעליה נוצרים כדוריות ולתקן את המכסה על הבמה של מיקרוסקופ אור.
התאם את המוקד העדין של המיקרוסקופ כדי להפוך כל ספירואיד לגלוי כפי שהודגם בעבר. לאחר לחיצה על כפתור הבוכנה כדי לרוקן בזהירות את האוויר מהמיקרופיט, הכנס את קצה הפיפטה לטיפה המכילה את הכדור שיש להעביר. התקרבו מאוד לספרואיד מבלי לגעת בו עם הקצה.
לאחר מכן, שחרר בעדינות את הלחץ על כפתור הבוכנה כדי לאפשר את היניקה של הכדור לתוך קצה micropipette בשני microliters של מדיה. לאחר מכן מעבירים את הכדור לטיפה חדשה התלויה על צלחת חדשה של 10 ס"מ מעוקב. קח תמונות של כדוריות בהגדלה של פי חמש באמצעות מיקרוסקופ הפוך מיום ההעברה ועד ליום השביעי של התרבות במדיה המותנית LX2.
כדי לנתח את התמונות של כדורי גדל, לפתוח כל תמונה כדורית בתוכנת ניתוח תמונה ולהשתמש בכלי בחירה חופשית כדי להתוות כל כדורי. לאחר מכן, מהלחצן הנפתח של הניתוח, בחר הגדר מדידה ולאחר מכן אזור ולחץ על אישור. לאחר מכן, ציירו עיגול באופן ידני סביב כל כדורי וברגע שהקף את הכדור מוקף בעיגול, הקש Control M כדי לאפשר לתוכנית לחשב את אזור הכדוריד בפיקסלים. לאחר מכן המר את האזור של הכדוריד לאמצעי אחסון באמצעות נוסחה זו.
לבסוף, חשב את השינוי בנפח כדורי ביחס לאמצעי האחסון שלו ביום הראשון של לכידת התמונה. במהלך אופטימיזציה של צפיפות התא להיווצרות כדורית, צפיפות זריעה גבוהה יותר של 12, 000 ו 6, 000 תאים הניבו כדוריות עם צורה אסימטרית, בעוד צפיפות זריעה של 3, 000 תאים נתנו כדורי 3D מעוגל מושלם. לפיכך, 3,000 כדורי צפיפות תאים הותאמו לניסויים נוספים.
הערכה אורכית של ההשפעה המתרבת מגידול פולחן משותף וקווי תאים פיברובלסטים הראתה כי מהיום הרביעי ואילך, כדוריות הטרוטיפיק גדלו בצורה עגולה אידיאלית בהשוואה לספרואידים הומוטיפיים. כדוריות הטרוטיפיות הראו בתחילה שלב צמיחה מהיר החל מהיום הרביעי ועד היום השביעי, ואחריו שלב איטי יותר ביום השמיני. נפח הכדוריד ירד לאחר מכן בימים 9 ו -10, אולי משקף את דלדול של חומרים מזינים או ליבה היפוקסית ומוות תאים.
לעומת זאת, כדורי ההומוטיפי הציגו עקומת צמיחה סטטית יחסית עד היום החמישי, ואחריה עלייה הדרגתית בעקומות הצמיחה שלהם מהיום השישי ואילך. קצב הצמיחה הגבוה יותר של כדורי הטרוטיפי מצביע על כך שהמגע הישיר בין הגידול לפיברובלסטים מגדיל את גודל כדורי הגידול. כאשר כדורי Hep3B הומוטיפיים בני שלושה ימים גדלו במדיה טרייה, התאים יצרו כדוריות מעוגלות לחלוטין לאחר שלושה ימים והראו התפשטות מתמשכת עד היום השביעי.
קצב הצמיחה הוגבר כאשר כדורי נשמרו במדיה המותנית LX2, דבר המצביע על התפשטות מונעת פיברובלסט של כדורי גידול. חשוב לוודא כי BBS סטרילי מתווסף לתחתית הכלים כדי לשמור על מצב לח מתאים להיווצרות כדורית. כמו כן, היזהר בעת היפוך המכסה, כך כדוריות טיפות לא שיבשו.
כדורי גידול תלת-ממדיים ניתנים לתיקון או להקפאה ולאחסנם עבור יישומים עתידיים כגון אימונוכימיה או אימונופלואורסצנטיות, כמו גם מיצוי RNA לניתוח תמלול. כדוריות הטרוטיפיות עם תאים מסומנים מראש ניתן לדמיין ולעקוב אחר כדי לספק תובנות על אינטראקציות תא-תאים בתוך microenvironment הגידול.
