פרוטוקול זה מסייע בגידול מקרופאגים שמקורם במח העצם מעכברים לקויים ב-iNOS או ב-BH4 תוך שימוש במדיה ובסרום מוגדרים בקפידה עם רמות נמוכות של BH4 וחנקות כדי למנוע הפרעה למנגנוני חמצון-חיזור. על ידי שליטה קפדנית ברמות המזהמים הפוטנציאליים בתהליך התרבית, אנו יכולים להגביל את ההפרעות של תחמוצת החנקן, ולהבטיח דיוק ושכפול של מערכת המודל. שיטה זו מאפשרת מדידות מדויקות של ביופטרינים, תחמוצת החנקן וכל הגורמים במורד הזרם הקשורים לתרכובות חיוניות אלה.
מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר תומאס ניקול, חוקר פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, להניח את הרגליים ב 70% אתנול במשך שתי דקות כדי לשטוף כל פרווה או שאריות. לאחר מכן, העבירו את הרגליים לצלחת פטרי בקטריולוגית נקייה וסטרילית.
בזהירות לגרד לאורך העצמות עם הלהב, לחתוך דרך גידים ולהסיר את השריר מהעצם. לאחר שהעצמות נוקו מהשרירים, נחתכו דרך האפיפיזה בחלק העליון של השוקה, ממש מתחת לברך. ניתן לחתוך את השוקה בקצה התחתון, ממש מעל הצומת עם הפיבולה.
לבסוף, חתכו את האפיפיזה בשני קצות עצם הירך, ממש בסמוך למפרקי הברך והירך. כדי לשטוף את מח העצם, למלא מזרק 10 מיליליטר עם 10 מיליליטר של PBS ולחבר אותו מחט. לאחר מכן להחדיר את המחט לחלל המדולרי של העצם.
יש לשטוף בעדינות עם מיליליטר אחד עד שני מיליליטרים של PBS, ולהריץ את המחט למעלה ולמטה. לאחר מכן, משכו את המתלים חמש עד עשר פעמים פנימה והחוצה ממזרק מיליליטר אחד כדי להתפרק. אספו את ההשעיה במזרק מיליליטר אחד והעבירו אותו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לצינור צנטריפוגה נקי של 50 מיליליטר.
לבסוף, הניחו את הדגימות על קרח. כדי להקפיא את מח העצם לשימוש מאוחר יותר, יש צנטריפוגה על התאים ב-1000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את ה-supernatant ולהחיות את הכדור האדום בשני מיליליטרים של נוגדי הקפאה.
לאחר מכן, דגירו אותו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. אם קפואים, מפשירים את המתלים במהירות ב-37 מעלות צלזיוס. העבירו את תרחיף התא לצינור סטרילי נקי המכיל שלושה מיליליטרים של מדיית DMEM/F-12.
לאחר מכן, גלול את התאים על ידי צנטריפוגה. יש להשליך את ה-supernatant ולהחזיר את הכדור לשלושה מיליליטרים של מדיית DMEM/F-12 המוכנה. ספרו את התאים וצלחו אותם בכלי פלסטיק שאינם מצופים ב-TC במדיית DMEM/F-12 המוכנה.
לאחר מכן, דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום החמישי, הזן את התאים על ידי הוספת 50% מהנפח המקורי של מדיית DMEM/F-12. ביום השישי, לגרות את התאים על ידי הוספת GM-CSF מוכן לריכוז סופי של 50 ננוגרם לכל מיקרוליטר ישירות למדיה של תרביות התאים.
ביום השביעי, הסר את כל המדיה מהתאים. לאחר מכן, שטפו את התאים לזמן קצר עם PBS שחוממו מראש והוסיפו מדיית DMEM/F-12 המכילה 2% אנדוטוקסין FBS נמוך, 1X פניצילין או סטרפטומיצין, L-גלוטמין, 25 ננוגרם למיקרוליטר M-CSF ו-50 ננוגרם למיקרוליטר GM-CSF. לבסוף, דגירו את התאים למשך הלילה במדיה כדי להפעיל את המקרופאגים לפנוטיפ M0.
עבור פנוטיפ M1, לעורר את התאים עם 100 ננוגרם לכל LPS מיקרוליטר, ו -10 ננוגרם לכל מיקרוליטר IFN-gamma. עבור פנוטיפ M2, לגרות את התאים עם 100 ננוגרם לכל microliter IL-4. דגירה של התאים למשך הלילה.
ביום השמיני, התאים מוכנים לקציר או לעיבוד במורד הזרם בהתאם לצרכי החוקר. במדיה שהושלמה עם 10% FBS היו ניטריט וטטרהידרוביופטרין דומים, ללא קשר ל-M-CSF ו-GM-CSF, או LCM. אבל רמות הביופטרין הכוללות היו גבוהות יותר במדיה עם תוספת LCM.
עם זאת, נצפתה שונות יותר בין אצוות LCM שונות. PCR הראה מוצר של זוג בסיסים 1030 בעכברים מסוג בר, בעוד שעכברי נוקאאוט GCH ייצרו מוצר של זוג בסיסים 1392, ואישרו כריתה של האקסונים הקריטיים. טיפול בטמוקסיפן ביטל את חלבון ה-GCH בתאי הנוקאאוט.
תאי נוקאאוט ובקרה עדיין ייצרו iNOS, בעקבות גירוי LPS ו-IFN. BMDMs תרבית מעכברי נוקאאוט GCH מותנים הציגו ירידה משמעותית בטטרהידרוביופטרין וירידה בניטריט. לאותם תאים בתרבית במדיית LCM לא היה ביטוי GCH1.
עם זאת, התאים מייצרים כמויות משמעותיות של טטרהידרוביופטרין וניטריט לאחר נוקאאוט. ביום השמיני, לא היו הבדלים משמעותיים במורפולוגיה בין שליטה לא פעילה לבין BMDMs של נוקאאוט GCH בריכוזים שונים של טמוקסיפן. ה-BMDMs מציגים את התכונות הצפויות מקרופאגים לא מגירים, עם תאים דביקים עגולים וגפיים מוארכות.
כאשר עובדים עם תא ראשוני כזה, זה הכרחי לעקר את כל הרקמות והציוד ביסודיות. יתר על כן, בחירת המדיה והתוסף הנכונים חשובה לשמירה על סביבה נמוכה של תחמוצת החנקן וה-BH4. ניתן להשתמש בכדורים ובמדיה של תאים עבור יישומים שונים במורד הזרם, תוך התמקדות בתפקיד של תחמוצת החנקן, ביופטרין או מצב חמצון-חיזור תאי.
זה עשוי לכלול HPLC, qPCR, וכתם מערבי, בין היתר.
