ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים

שמירה על הכדאיות הפוטנציאלית של ביצית לאחר אחסון לטווח ארוך מייצגת כלי של הזדמנות גדולה, שכן היא תשפר את הרבייה של בעלי חיים מקומיים על ידי תוכניות בחירה גנטית, תתרום לשימור המגוון הביולוגי באמצעות שימור מינים של חיות בר, ותגדיל את המחקר בביוטכנולוגיה. ויטריפיקציה של ביציות לנוער הייתה קצרה בהרבה במרווח הייצור בתוכניות הרבייה. גירוי על ידי קירור אולטרה-קירור והתחממות נחשב לגישה סטנדרטית בשימור ביציות בקר.

עם זאת, בכבשים הליך זה עדיין נחשב חדש יחסית שיטה סטנדרטית חסרה. בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול להסתבכות של ביצית כבשים, שנאסף מתורמים צעירים ובוגרים כאחד, ובמסירות התבגר לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים מהתרבות במבחנה, vitrification, התחממות, ותרבות שלאחר ההתחממות.

לאחר שחזור קומפלקס ביציות קומולוס, שם התבגר במבחנה במשך 24 שעות במצב סטטי הכולל עבור ביצית לנוער, תוספת עם מאה מיקרומולאר של trehalose במדיום התבגרות. לאחר התבגרות במבחנה, הביציות היו שקעים של תאים Cumulus מכנית על ידי צינור בעדינות נבדק תחת מיקרוסקופ סטריאו, עם הגדלה 60x. הבחירה של ביציות להגיש בהליכי vitrification מייצגים את הצעד החשוב הראשון כדי אחריות על היישום המוצלח של הליך זה.

רק אלה עם ציטופלסמה אחידה, עם התפלגות הומוגנית של טיפות השומנים, שלמות של כל אמה רחב ורציף מרכזי בחלל, קומפקטי zona pellucida הקוטר החיצוני של כ 19 מיקרומטר ומראה את ההבלטה של גוף הקוטב הראשון, ולכן ב M2, שלב יש לבחור. Vitrification בוצעה בשיטת נפח חיוני מינימלי, עם מכשיר Cryotops. לאחר הבחירה, קבוצה של חמישה ביציות לנוער הותנו ב 38.5 מעלות צלזיוס במדיום בסיס במשך שתי דקות.

ביציות היו אז מיובש על ידי שלוש דקות חשיפה לפתרון כיול. הטעינה של הביצית במכשיר הוויטריפיקציה המשמש היא צעד חשוב וקריטי. Cryotop משתמש ברצועת פוליפרופילן המחוברת למחזיק.

בשיטה זו, הביציות בתמיסת הרטט, פחות מ -0 נקודות מיליליטר נטענות במהירות עם נימי זכוכית על גבי רצועת הסרט. אז הפתרון חייב להיות מוסר, משאיר מאחור שכבה דקה מספיק כדי לכסות את התאים להיות cryopreserved. לפני שנטען במכשיר Cryotop וצלל ישירות לתוך חנקן נוזלי בתוך 30 שניות.

עבור טמפרטורה ביולוגית פנימית חמה, התוכן של כל מכשיר vitrification הועבר חנקן נוזלי לתוך 200 טיפות microliter של תמיסת trehalose פוחתת. ביציות הועברו סט היה, גרירת ביציות עם פיפטה דקה, זכוכית, כדי לקדם את הסרת cryoprotectants תאיים. לבסוף, ביציות היו טרום רבייה במדיום בסיס באינקובטור ב 5% פחמן דו חמצני.

מיד לאחר ההתחממות, ועל כל נקודת זמן של תרבות שלאחר ההתחממות, ביציות הוערכו מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם הגדלה של 100x. סובלנות ההקפאה של ביציות מתורמים צעירים נמוכה יותר בהשוואה לאלה שהשתנו עם שלמות קרום נמוכה יותר לאחר ההתחממות. השימוש trehalose במדיום התבגרות המושרה ביציות לנוער שלמות קרום גבוהה יותר, להגדיל את שיעורי ההישרדות לאחר vitrification.

עם זאת מחשוף, הפריה, ושיעורים התפתחותיים של ביציות לנוער לא גדלו על ידי תוספי trehalose. השימוש במדיה עם ריכוז סידן שווה 2.2 מיליגרם deciliter עבור vitrification של ביציות לנוער, צריך שיעורי הפריה גבוהים יותר לעומת ביציות רוטט עם ריכוז סידן, אבל לא נמצאו הבדלים המאפשרים ייצור. על ידי השוואת התרבות שלאחר ההתחממות על משכים שונים, הראינו כי לאחר ארבע שעות של תרבות ביצית שנאספו מן הזוגות הישנים מסוגלים לשחזר את הקשרים האנרגטיים ואת ההתקנה microtubular, ולהחזיר את היכולת ההתפתחותית עם מחשוף גבוה יותר ופסולת blastocytes.

הפעילות המיטוכונדרית הייתה גבוהה יותר ביציות נעורים חמות לאחר ארבע שעות של תרבות שלאחר ההתחממות, בהשוואה לנקודות זמן אחרות. הפרידה מהחלוקה המיטוכונדרית השתנתה גם במהלך שש שעות של תרבות התחממות פוסט. יתר על כן, רמות תאיים של מיני חמצן תגובתי היו נמוכים משמעותית ביציות לנוער בשעתיים של תרבות שלאחר ההתחממות לעומת 0, 4, ו 6 שעות.

עם זאת, ובניגוד למה שנמצא ביציות אחרות, שיעורי ההפעלה הפרתנוגנית הספונטנית עלו במהלך התרבות שלאחר ההתחממות ביציות לנוער. אחד היתרונות העיקריים של השיטה המוצעת הוא שהיא כוללת את כל השלבים מאוסף ביציות להתבגרות במבחנה, ויטריפיקציה והתחממות. יתר על כן, הוא כולל תקופת תרבות שלאחר ההתחממות כדי לאפשר התאוששות ביצית מהנזקים שנגרמו במהלך הליך הוויטריפיקציה.

בחירת הזמן האופטימלי להפריה היא מאתגרת, והיא עשויה להשפיע על תוצאות תוכנית הוויטריפיקציה. כמו כן יש לקחת בחשבון כי, שלא כמו הקפאה איטית, vitrification היא טכניקה ידנית, ולכן הוא תלוי באופרטור. מסיבה זו, אתגר מרכזי הוא הצורך בטכנאים וחוקרים מיומנים המתחשבים באפקט המפעיל בהערכת תוצאות תוכנית הוויטריפיקציה.

מחקרים נוספים מהמעבדה שלנו יאפשרו לנסות לתקנן את הליך הוויטריפיקציה והבחירה של ביצית, ובתאימה טובה יותר של הרכב המדיה לצרכים של הביצית הצעירה. התעלמות מהשימוש בתרבות ואופי ונוגדי חמצון שאנו מציעים הזדמנויות מבטיחות.