עבודת מחקר זו זכתה לתמיכה כספית מהאיחוד האירופי (transMed; H2020-MSCA-765441), מועצת המחקר הגרמנית (DFG; PA1751/8-1, 10-1) ומועצת המלגות של סין.

פרוטוקולים של בעלי חיים התואמים את §4 לחוק הגרמני להגנה על בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה להגנה על בעלי חיים באוניברסיטת טיבינגן (Einrichtung für Tierschutz , Tierärztlichen Dienst ו- Labortierkunde; מספר רישום AK02/19M). במחקר זה, רשתית התקבלו סוג פראי (WT) ועכברים rd1, האחרון להיות מודל מאופיין היטב עבור ניוון רשתיתתורשתית 15. עכברים שוכנו תחת תאורה מחזורית לבנה סטנדרטית, הייתה להם גישה חופשית למזון ומים, ושימשו ללא קשר למגדר.
1. רשימת פעולות לביצוע
<ol><li>כדי להבטיח תנאים סטריליים ולמנוע זיהומים, לנקות ולחטא את מכסה המנוע של זרימת האוויר למינאר עם 70% אתנול. הקפד לתת אתנול להתאדות לחלוטין, כדי למנוע שיכרון של תרבויות הרשתית.</li>
	<li>כלי מובלעת אוטומטית (למשל, מספריים, מלקחיים וכף גירוד מיקרוסקופ עיניים) לפני השימוש.</li>
	<li>הכינו את המדיה הבאה מראש תחת מכסה המנוע לזרימה למינארית, בתנאים סטריליים: בזל R16 בינוני (BM) (ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 4 שבועות), BM עם 20% סרום עגל עוברי (FCS) (שימוש באותו יום), BM עם 0.12% חלבון K (44 mAnson U /mg) פתרון (באותו יום שימוש) ואת R16 בינוני מלא עם תוספי מזון (CM) כמתואר על ידי Romijn16 (ניתן לאחסן ב 4 °C (במשך 3 שבועות) (ראה שולחנות S1, S2, ו S3).</li>
	<li>מחממים מראש את הפתרון proteinase K ב 37 °C (70 °F) כדי להפעיל אותו ולהשתמש בו בשלב 2.5.</li>
</ol>2. הכנה
<ol><li>להקריב rd1/ WT בעלי חיים ביום שלאחר הלידה (P) 5 על ידי עריפת ראש. עבור בעלי חיים מעל גיל P11, יש להשתמש ב-CO2 ו/או נקע בצוואר הרחם, בהתאם לתקנות המקומיות להגנה על בעלי חיים.</li>
	<li>בהתאם לגיל החיה, לפני ההקמה, במידת הצורך, לפתוח את מכסי העין באמצעות מלקחיים בזהירות רבה להפריד את מכסי העין, מבלי לגעת או לגרד את העין מתחת.</li>
	<li>חודרים במהירות את העיניים מתחת לסטריאוסקופ באמצעות מלקחיים מעוגלים.</li>
	<li>דגירה את העיניים BM במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>דגירה את העיניים BM שחומם מראש, עם 0.12% פרוטאין K ב 37 °C (70 °F) במשך 15 דקות.</li>
	<li>בצע את השלבים הבאים בתוך מכסה המנוע של זרימת אוויר למינארי כדי להבטיח תנאים סטריליים. כדי להשבית את proteinase K, להעביר את העיניים BM המכיל 20% FCS ודגרת במשך 5 דקות ב RT.</li>
	<li>לנתח את העיניים תחת סטריאוסקופ, באופן א-הולם, בצלחת פטרי המכילה BM טרי ב RT. ליזום את הניתוח בהקדם האפשרי לאחר ההטמעה. ככל שהזמן הזה ארוך יותר, כך קשה יותר לנתח את הרשתית, העיניים נעשות רכות מאוד.<ol>
<li>עם מלקחיים, להחזיק את העין מעצב הראייה. בעזרת מספריים עדינות, בצעו חתך קטן בקרנית ויצרו 2 קצוות מהמקום שבו ניתן לקלף בעדינות את הקרנית, הצ'ורויד והסקלרה באמצעות 2 זוגות מלקחיים עדינים(איור 1 שלבים A-C). לחלופין, השתמש בקנולה צרה כדי לבצע חתך ראשון לתוך הקרנית ולאחר מכן להכניס את אחד להבי המספריים לתוך הפתח.</li>
		<li>לתפוס את העדשה עם מלקחיים עדינים. מקם זוג מלקחיים שני בניצב לראשון, כך שהמלקחיים הראשונים הם בין 2 השוקיים של השני. משוך כדי לחלץ את העדשה מכוס העין. אם הגופן הנבזה וגוף הסיליארי עדיין מחוברים לרשתית, הסר אותם בזהירות(איור 1 שלב ד'). הערה: שלבים 2.7.1 ו- 2.7.2 זקוקים לתרגול ולהבטיח זהירות כדי לא לפגוע ברשתית.</li>
		<li>חותכים את הרשתית בניצב לקצותיה בארבע נקודות ויוצרים צורת תלתן בעלת ארבעה עלים(איור 1 שלבים E-F).</li>
		<li>באמצעות פיפטה עם בסיס חתוך באופן נרחב של קצה 1 מ"ל, להחזיק את הרשתית בטיפה תלויה של מדיום ולהעביר אותו למסנן צלחת תרבות להוסיף ממוקם בצלחת תרבות 6-well. שכבת ה-RPE צריכה לפנות לקרום(איור 1 שלב G).</li>
		<li>באמצעות פיפטה, הסר בזהירות את המדיום העודף מההוספה.</li>
		<li>מצדי הבאר, מוסיפים 1 מ"ל של CM לבאר ומדגירה באינקובטור סטרילי ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2. אין להטביע את הרשתית במדיום שכן זה יפחית חמצון ויגרום לניוון רקמות. האקספלנט צריך להישאר בממשק בין נוזל לאוויר, מכוסה רק על ידי סרט דק של נוזל שנוצר על ידי מתח פני השטח של המים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השאירו את explant הרשתית ללא הפרעה במשך 48 h הראשון כדי להקל על ההתאוששות לאחר הליך explantation.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל יום שני (48 שעות). השלך 700 μL של מדיום מכל באר ולהוסיף 900 μL של CM טרי לבאר. בדרך זו, כמות המדיום שאבד על ידי אידוי הוא התאושש ואת explant הרשתית שומרת על כמה גורמים neuroprotective המיוצר הקודם 48 שעות.</li>
	<li>דגירה המדיום הוסר בצינור microcentrifuge נפרד וסגור יחד עם התרבויות כדי לשלוט ולהעריך זיהום אפשרי (כלומר, שינוי בצבע של המדיום). הערה: קללות רשתית ניתן לשמור בתרבות לפחות 2 שבועות12.</li>
</ol>3. לאחר הכת
הערה: Explants יכול לשמש עבור יישומים ניסיוניים שונים (כתם מערבי, היסטולוגיה, mounts שלם, ניתוח גנטי, אלקטרופיזיולוגיה). בהתאם ליישום, explants רשתית organotypic ניתן לצלם קפוא, lysed, או מוכן cryosectioning. השלבים הבאים מתארים הכנה היסטולוגית.
<ol><li>בצע קיבעון של 45 דקות עם 4% paraformaldehyde (PFA), ואחריו cryoprotection סוכרוז הדרגתי (10% סוכרוז במשך 10 דקות, 20% במשך 20 דקות ו 30% עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר (RT) או לילה (ON) ב 4 מעלות צלזיוס). הוסף מאגרים אלה ישירות לבאר.</li>
	<li>חותכים את הממברנה סביב מקלפי הרשתית.</li>
	<li>להטמיע הן את הממברנה ואת רקמת הרשתית במדיום עבור רקמות קפואות.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> איור 1: הליך שלב אחר שלב להכנת תרבויות אקספלנט רשתית אורגנוטיפיות. (A)עיני עכבר מורחבות ומועברות לפתרון של פרוטאינאז K כדי לאפשר הפרדת סקלרה וכורוידים מהרשתית וה- RPE. חתך קטן בשכבת סקלרה / choroid הוא הציג. (B)שני מלקחיים משמשים לקלף את שכבת סקלרה / choroid. (ג)ניתן לראות את שכבת הצ'ורויד השחורה במהלך הקילוף. אפיתל פיגמנט רשתית כהה קו תחתון (RPE) נשאר מחובר לגלגל העין. הסקלרה והכורוידים מוסרים יחד עם עצב הראייה. (D)העדשה והזירם מופקים עם מלקחיים.  גוף ciliary הנותרים מוסר. הרשתיתשומרת על צורה דמוית קערה. (ו)כדי לשטח את הרשתית עבור culturing בצלחת, 4 חתכים במרחק שווה סביב הרשתית נעשים עם מספריים, נותן לו צורה דמוית תלתן. תרבות הרשתית מועברת לתרבות קרום להכניס צלחת 6-באר עם שימוש טיפ פיפטה לחתוך 1 מ"ל. הרשתית עדיין שומרת על חלק מצורת הקערה. עם זאת, עם הסרת הנוזל העודף המקיף את הרשתית, הוא ייפתח למבנה מישורי. (G) במערך קרום התרבות, תרבות הרשתית נחה על קרום פוליקרבונט נקבובי (PC) על גבי פתרון של מדיום R16 מלא. כדי להבטיח את הכדאיות, יש לשמור את התרבות באינקובטור סטרילי לח ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2, ואת המדיום צריך להיות מוחלף כל 48 שעות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה</a>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול שהוצג מתאר תרבויות הסבר אורגנוטיות של רשתית עכבר עם RPE שלם במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. פרוטוקול זה פותח במקור החל מסוף שנות השמונים7,28 ומאז הוא שוכלל ברציפות6,11,12. יישומים בולטים כוללים מחקרים לתוך המנגנונים של ניוון רשתית תורשתית וזיהוי של תרופות retinoprotective23,29,30.
לניסוי מוצלח, יש לקחת בחשבון כמה שיקולים חשובים. להלן מספר נקודות חשובות לפתרון בעיות שיסייעו בשיפור איכות התרבויות. ראשית, תרבויות הרשתית עשויות להציג קיפול מוגזם ו / או היווצרות רוזט31. זה יכול להיגרם על ידי נגיעה ברשתית עם מלקחיים במהלך הליך ההסברה. יתר על כן, הגוף ciliary חייב להיות מוסר לחלוטין מן explant, כמו זה יכול להגדיל את קיפול הרשתית במהלך התרבות. שנית, במהלך העברת הרשתית לצלחת הבאר בטיפה תלויה, אם הרשתית פונה לקרום בצד הלא נכון למטה, לשמור אותו בירידה תלוי מקצה פיפטה בעדינות רבה לדחוף את המדיום פנימה והחוצה של הקצה (מבלי לנתק את טיפת התלייה) כדי להפוך את הרשתית מסביב. לבסוף, אם RPE נשאר מחובר סקלרה וניתוקים מן הרשתית, זה נגרם ככל הנראה על ידי עיכול לא מספיק של סקלרה. בעיה זו יכולה להיות חשובה במיוחד כאשר עובדים עם עיניים מבעלי חיים מבוגרים או מינים שאינם מכרסמים (למשל, חזירים) וניתן לפתור אותה על ידי הגדלת ריכוז החלבון K.
ניהול תרבויות רשתית אורגנוטיפית הוא הליך מורכב הדורש הכשרה וניסיון נאותים. חוסר אימון יכול להוביל לשונות באיכות של מקלפי הרשתית. מסיבות אלה, חשוב לנטר ולאמת את הכדאיות ואת הרבייה, המאפיינים, למשל, את שיעור המוות של תאים עם הבדיקה TUNEL. השימוש במדיום ללא אנטיביוטיקה הופך את מקללי הרשתית לפגיעים לזיהום על ידי חיידקים ופטריות. כדי למזער סיכון זה, אנו ממליצים כי טיפול מסוים נלקח לעבוד בתנאים אספטיים באמת. מגבלה נוספת של פולחן רשתית במבחנה הם הבדלים בסביבה הפיזיוכימית בהשוואה לרשתית in vivo (למשל, אספקת דם choroidal ורשתית, רמות חמצן וגלוקוז, לחץ תוך עיני, הרכב של הזגוגית). מערכת זלוף רציפה, אולי מוטבע לתוך bioreactor ייעודי32 יכול להפוך את הדגם הזה קרוב יותר למצב in vivo. יתר על כן, אקסוטומיה של עצב הראייה במהלך ניתוח רשתית יוביל למוות תא גנגליון, זה יכול לגרום לתגובות מתח8. לכן, מומלץ להשאיר את ההסבר להסתגל לתנאי culturing לפחות 2 ימים במבחנה לפני שהוא נתון מניפולציה ספציפית או טיפול.
השיטה המתוארת מבוצעת בדרך כלל על רקמות רשתית לא בוגרות, אשר עשוי לשרוד היטב במשך 4 שבועות במבחנה7,33. עם זאת, ההליך מותאם למגוון יישומים, כולל culturing של רשתית למבוגרים. למרות גישות שפורסמו שונים לתאר את הבידוד של הרשתית הבוגרת ללא RPE שלה34,35, הדגירה עם פתרון פפאין עד 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס לפני הניתוח מאפשר RPE להישאר מחובר לרשתית גם כאשר נגזר עכבר בוגר36.
המדיום נטול הסרום וסביבת הפריה המוגדרת כימית מספקים מניפולציה מוגדרת לחלוטין וניתן לשחזור של תנאי הניסוי. לכן, תרבויות הסבר רשתית organotypic הם כלים בעלי ערך בתחום הרפואת עיניים ומדעי המוח, ושימשו לחקר מחלות רשתית37, התפתחות הרשתית38,39, טיפול בתאי גזע ברשתית40, שינויים גנטיים41, הקרנה תרופתית. כדוגמה ספציפית לבדיקות סמים, השתמשנו כאן בתרבויות של אקספלנט ברשתית כדי לבדוק אנלוגי cGMP (CN003), הידוע כמפחית מוות של תאי פוטורצפטור במודלים של בעלי חיים למחלת רשתית תורשתית23 (איור 3B). יישום אפשרי נוסף של הטכניקה מתואר באיור 3C, הממחיש כיצד ניתן לנצל את השליטה המדויקת בסביבת הרקמה כדי לחקות תנאי סוכרת24. בשל שימור ארכיטקטורת הרקמות לאורך כל תקופת הכת, תרביות האקספלנט הרשתית האורגנוטיפיות מתאימות גם למחקרים אלקטרופיזיולוגיים. פונקציונליות עצבית על explants רשתית נחקרו באמצעות הקלטת תיקון מהדק42 ו multi-electrode-מערך (MEA) הקלטה33,43. זה האחרון מאפשר הקלטה של פעילות חשמלית של אוכלוסיות עצביות באותו זמן כבר מנוצל לאפיין פוטורצפטור פונקציונליות תא גנגליון בתנאי תרבות. בפרספקטיבה רחבה יותר, ניתן ליישם את מערכות תרבות ההסברה האורגנוטיפיות גם במחקר פרה-קליני, שבו תרבויות הסבר שימשו לבדיקת היעילות הטיפולית של היפותרמיה44.
טכניקת culturing explanuring organotypic הוא פשוט יחסית לבצע, בהשוואה לניסויים מקבילים vivo, הוא פחות יקר זמן רב, ומונע את החששות האתיים הקשורים מחקרים בבעלי חיים. השליטה המדויקת בתנאי הניסוי ובשימור RPE ומורכבות הרקמות הופכים את השיטה לכלי רב ערך לשיפור הידע שלנו על פיזיולוגיה ברשתית ופתופיזיולוגיה ולאפשר יישומים ניסיוניים רבים.

במחקר עיניים, מגוון מודלים זמינים ללמוד את הרשתית, כולל תרביות תאי רשתית ראשוניות, קווי תאים שמקורם ברשתית, אורגנואידים ברשתית, ובמודלים של בעלי חיים vivo 1,2,3,4,5. עם זאת, כל אחד מהמודלים הללו סובל מחסרונות. לדוגמה, תאים גדלים בבידוד בעוד הרשתית היא רשת מורכבת עם שפע של אינטראקציות תא לתא. לכן, ההתנהגות של תרביות תאים מבודדים עשויה להיות מלאכותית בהשוואה לזה שנצפה ברקמה שלמה. בעיה זו יכולה להיות מתוקנת בחלקה באמצעות אורגנואידים רשתית מובחנים במבחנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד התפתחות וביולוגיה בסיסית6. עם זאת, נכון להיום, דור האורגנואידים ברשתית עדיין גוזל זמן רב, עתיר עבודה וסובל מבעיות רבייה, הדורשות עבודת פיתוח משמעותית נוספת לפני שניתן יהיה להשתמש באורגנואידים למחקר רשתית תרגום. לבסוף, מחקרים על בעלי חיים חיים, בעוד שניתן לטעון את המודל הקרוב ביותר לדרישות של מחקר עיניים, קשורים עם חששות אתיים חזקים. פשרה טובה בין היעילות של מערכות תרביות תאים לבין המצב האמיתי של מודלים של בעלי חיים in vivo הם תרבויות explant רשתית organotypic. תרבויות כאלה גם להפחית את הסבל של בעלי חיים מאז אין התערבויות in vivo מבוצעים.
מספר שיטות תוארו עבור culturing גולים רשתית ממינים שונים5,7,8. הפרוטוקול שלנו מתאר טכניקה לבידוד של נוירורטינה העכבר יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE). טכניקה זו תתאים גם לתרבויות רשתית עכברוש9. התרבות של נוירורטינה יחד עם RPE שלה הוא בעל חשיבות רבה להצלחה. RPE מבצע פונקציות חיוניות עבור הרשתית: הובלת חומרים מזינים, יונים, מים, ספיגת אור והגנה מפני פוטואוקסידציה, איזומריזציה מחדש של כל טרנס-רשתית לתוך 11-cis-רשתית, אשר חיוני עבור מחזור הראייה, phagocytosis של ממברנות פוטורצפטור לשפוך, והפרשת גורמים חיוניים לשלמות המבנית של הרשתית10. שמירה על RPE מאפשר פיתוח מוצלח של קטעים החיצוניים והפנימיים photoreceptor, שמירה על הרשתית קיימא במשך זמן רב יותר11. ההליך המתואר להלן משמר את המאפיינים ההיסטוטיפיים והפיזיולוגיים של הרשתית לפחות שבועיים12. יתר על כן, culturing explants הרשתית organotypic במדיום ללא סרום, ללא אנטיביוטיקה נמנע נוכחות של חומרים לא ידועים ומאפשר פרשנות ישירה של התוצאות12.
תרבויות אקספלנט רשתית organotypic היו חיוניים לשיפור הידע שלנו על התפתחות הרשתית ניוון7,13,14. אנו מראים כאן כי הם גם כלי שימושי עבור הקרנה תרופתי וכי הם יכולים להיות מועסקים כדי מודל מגוון רחב של מחלות רשתית, כולל רטינופתיה סוכרתית.

<table><tbody><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>(+/-)-&amp;alpha;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>CDP-Choline-Na</td><td>Sigma</td><td>30290</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterone</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;times; 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8027</td><td></td></tr><tr><td>DL-Tocopherol</td><td>Sigma</td><td>T1539</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>E0135</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&amp;micro;m</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3942.101</td><td>for Basal Medium</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>L-CysteineHCl</td><td>Sigma</td><td>C7477</td><td></td></tr><tr><td>Linoleic Acid</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolenic Acid</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;x 4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>NaSeO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;x 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td><td>F.S.T.</td><td>10360-13</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>21935025</td><td>44 mAnson U/mg</td></tr><tr><td>R16</td><td>Gibco</td><td>07491252A</td><td></td></tr><tr><td>Retinol</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td></td></tr><tr><td>Retinyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter 0.22&amp;micro;m</td><td>MILLEX GP</td><td>SLGP033RS</td><td>for supplements</td></tr><tr><td>T3&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Tocopherylacetate</td><td>Sigma</td><td>T1157</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeable supports</td><td>Corning</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B1</td><td>Sigma</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

במחקר עיניים, יש צורך חזק מודלים במבחנה של נוירורטינה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור culturing organotypic שלהרשתית הנוירולוגיתשל העכבר עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם (RPE). בהתאם לשאלת המחקר, רטינות יכולות להיות מבודדות מבעלי חיים מסוג בר או ממודלים של מחלות, כדי ללמוד, למשל, רטינופתיה סוכרתית או ניוון רשתית תורשתי. עיניים מתחילת היום שלאחר הלידה 2-9 בעלי חיים הם enucleated בתנאים אספטיים. הם מתעכלים חלקית בחלבון K כדי לאפשר ניתוק של choroid מן RPE. תחת הסטריאוסקופ, חתך קטן נעשה בקרנית יצירת שני קצוות מהמקום שבו choroid ו sclera ניתן לקלף בעדינות מן RPE ו neuroretina. לאחר מכן מסירים את העדשה, וה eyecup נחתך בארבע נקודות כדי להעניק לה צורה בעלת ארבעה טריזים הדומה לעלה תלתן. הרקמה מועברת לבסוף בירידה תלויה לתוך תרבית תאים להוסיף מחזיק קרום culturing פוליקרבונט. התרבויות נשמרות לאחר מכן במדיום R16, ללא סרום או אנטיביוטיקה, בתנאים מוגדרים לחלוטין, עם שינוי בינוני בכל יום שני.
ההליך המתואר מאפשר בידוד של הרשתית ושמירה על ההקשר הפיזיולוגי וההיסטוטיפי הרגיל שלה לתקופות של שבועיים לפחות. תכונות אלה הופכות את תרבויות האקספלנט ברשתית האורגנוטיפית למודל מצוין עם ערך חיזוי גבוה, למחקרים על התפתחות הרשתית, מנגנוני מחלות ואלקטרופיזיולוגיה, תוך מתן אפשרות להקרנה תרופתית.

לאחר ביצוע הפרוטוקול, גישושים ברשתית מנותח ותרבותי משמרים את ארכיטקטורת הרקמות הרגילה שלהם, עם שכבות נפרדות, מ- RPE לשכבת תא הגנגליון (GCL), כפי שמוצג באיור 2. השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) וגודל השכבה הגרעינית הפנימית (INL) נשארו יציבים ברובם במשך 2-3 שבועות, עם אובדן תאים מתקדם לאט ודילול הדרגתי של שכבות אלה הופכים ברורים יותר ויותר אם תקופת הכת ממושכת ל -4 שבועות ומעבר. ב- GCL, לעומת זאת, בגלל האקסוטומיה של עצב הראייה, דילול מסומן נצפתה בדרך כלל בתוך 4 הימים הראשונים של culturing. לאחר מכן, אוכלוסיית התאים הנותרים ב- GCL (בעיקר תאי אקרין עקורים) תמשיך להיות בת קיימא עוד 3-4 שבועות17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> איור 2: סוגי תאים הנמצאים בתרבות האקספלנט ברשתית. תרבות ההסבר ברשתית ב- P11 נגזרת מחיות מוטנט rd1 (A)ו- WT (B) המציגות כתמים גרעיניים עם DAPI (שמאל, כחול), פוטורצפטורים מוט (מרכז, אדום) ותאי מולר (ימין, ירוק). הכתם הגרעיני מדגיש את כל השכבות התאיות העיקריות של הרשתית כגון אפיתל פיגמנט רשתית (RPE), שכבה גרעינית חוצה (ONL), שכבה גרעינית פנימית (INL) ושכבת תא גנגליון (GCL). סוגי תאים ספציפיים בשכבות הגרעיניות, כגון מוטות ותאי מולר, הם immunolabeled עם אלפא arrestin26 ו גלוטמין סינתטאז27 נוגדנים, בהתאמה. (C) מציג קטע באורך מלא של   רשתית עכברrd1 שלמה, עם כתמי DAPI המדגישים את העקביות, האינטגרציה וההתפתחות של הרשתית. הרשתיתות האלה היו תרבותיות במשך 6 ימים. תיאור הנוהל: רשתית ו- RPE הנגזרים מבעלי חיים rd1 או WT בודדו ב- P5 ותרבית כמתואר בפרוטוקול, עד P11 עם שינוי בינוני כל 48 שעות. תרבויות תוקנו עם 4% PFA ב P11 ו cryosectioned. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה</a>
מדיום ללא סרום וסביבת הפריה חוץ גופית מתמשכת מאפשרים שליטה מלאה על תנאי הניסוי. כאן, אנו מספקים שתי דוגמאות ליישומים ספציפיים של פרוטוקול זה. הדוגמה הראשונה ממחישה את האפשרות להשתמש בקללות רשתית למטרות בדיקות סמים או סינון. תרבויות אקספלנט רשתית אורגנוטיפיות הוכנו מדגמי עכברים מסוג פראי (WT) ו- rd1. זה האחרון הוא מודל מאופיין היטב עבור ניוון רשתית15. ברשתית העכבר rd1, ניוון ONL מופעלת על ידי רמות גבוהות באופן חריג של cGMP ב מוט photoreceptors6,20. cGMP מוגזם גורם לפעילות מוגברת של תעלות יון מגודרות נוקלאוטידים מחזוריים (CNGCs) וקינאז חלבון תלוי cGMP (PKG), המוביל למוות תאי21. הטיפול ברשתיות עכבר rd1 עם אנלוגי מבני ל- cGMP (נוקלאוטידים מחזוריים #3; CN003), אשר מטרות הן PKG ו CNGC, נבדק. לאחר הסברה ב-P5, הגיעה הפרדיגמה הטיפולית המתוארת באיור 3A. תרבויות האקספלנט תוקנו עם 4% PFA ב-P11 והוכנו להקפאה(איור 3A). כדי להעריך את מוות התא של חלקים היסטולוגיים ממטופלים, שאינם מטופלים (NT), ודגימות WT, deoxynucleotidyl מסוף transferase dUTP ניק סוף תיוג (TUNEL) assay22 בוצע. הניתוח של תאים המסומנים בתווי TUNEL הראה אחוז גבוה של תאים גוססים ב- ONL של הדגימות הלא מטופלות rd1, בעוד CN003 מוגן rd1 פוטורצפטורים של העכבר כאשר מוחל בריכוז של 50 מיקרומטר23 (איור 3B).
סיבוך שכיח של סוכרת הוא רטינופתיה סוכרתית, מחלה מסנוורת שקשה להתרבות בנאמנות במודלים של בעליחיים 5. הדוגמה השנייה מדגישה את השימוש בתרבויות אקספלנט רשתית organotypic לאפיין את הכדאיות של התא ברשתית בתנאים לחקות סוכרת מסוג 2 (T2DM)24. כאן, השתמשנו 20 מ"מ של מעכב גליקוליזה 2-deoxy-גלוקוז (2-DG)25 ונתנו אותו למדיום התרבות במשך 24 שעות מ P10 ל P11. אנו מראים כי הכפפת מקלפי רשתית WT לתנאים סוכרתיים מדומים במבחנה מובילה למוות תאי עצבי נרחב של הרשתית(איור 3C). פרדיגמה זו בתורה עשויה לשמש, למשל, כדי ללמוד מנגנונים ניווניים או כדי לבדוק טיפולים retinoprotective בהקשר סוכרת.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> איור 3: שתי דוגמאות ליישומים של תרבויות אקספלנט רשתית אורגנוטיפיות. (A) תיאור הליך: רשתית ו- RPE הנגזרים מחיות rd1 או WT בודדו ביום שלאחר הלידה (P) 5 ותרבית כמתואר לעיל, עם שינוי בינוני כל 48 שעות. ב P7 ו P9, המדיום בילה הושלך CM טרי המכיל תרכובת פעילה בריכוז של 50 מיקרומטר נוסף לצלחת. תרבויות תוקנו עם 4% PFA ב P11 ו cryosectioned. (B)בדיקות מורכבות על רשתית rd1. קטעים התקבלו מתרבויות WT, מטופלים (003) ולא מטופלים (NT) ברשתית. מבחני TUNEL (אדום) שימשו כסמן למוות תאי. כתמים גרעיניים עם DAPI (כחול). הכימות המוצג בגרף עמודות מדגים את אחוזי התאים הגוססים במצב WT, rd1 NT ו- rd1 003. טיפול עם תרכובת 003 מופחת באופן משמעותי rd1 פוטורצפטור מוות תא. (C) סימולציה של סוכרת מסוג 2 (T2DM) על רשתית WT באמצעות טיפול 2-deoxy-גלוקוז (2-DG). מבחני TUNEL בוצעו בדגימות NT ו- T2DM. הכימות מצביע על עלייה משמעותית מאוד במוות התאים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה</a>
שולחן S1. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה</a>  
שולחן S2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה</a>  
שולחן S3. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

הפרוטוקול מתאר explants organotypic שלרשתית נוירוהעכבר , מעובד יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE), במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. שיטה זו פשוטה יחסית לביצוע, זולה יותר וגוזלת זמן בהשוואה לניסויי vivo, וניתן להתאים אותה ליישומים ניסיוניים רבים.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

long-term-serum-free-cultivation-organotypic-mouse-retina-explants

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Views.  University of Tübingen. הפרוטוקול מתאר explants organotypic שלרשתית נוירוהעכבר , מעובד יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE), במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. שיטה זו פשוטה יחסית לביצוע, זולה יותר וגוזלת זמן בהשוואה לניסויי vivo, וניתן להתאים אותה ל...

Video: Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

תרבות Organotypic של הרשתית מלא עובי למבוגרים חזירי

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Developmental Biology

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Biology

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority of RP patients have progressive photoreceptor degeneration leading to peripheral vision loss, night blindness, and finally, total blindness. To date, thousands of mutations in more than 90 genes have been reported to be associated with RP. Currently, there are few animal models available for all the affected genes and different types of mutations, which largely hampers the deciphering of the mechanisms underlying the gene/mutation pathology and limits treatment and drug development. Patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids (ROs) have provided a better system to model the human early-onset disease than cells and animals. In order to study RP, those patient-derived 3D retinal organoids were utilized to recapitulate the clinical phenotypes of RP. In the RP patient-derived ROs, Rhodopsin mislocalization was clearly displayed. Compared with other animal models, patient iPSC-derived retinal organoid models more closely recapitulated RP features and represent an ideal approach for investigating the disease pathogenesis and for drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>יצירת אורגנואידים רשתית שמקורם ב-iPSC של מטופלים אנושיים למודל רטיניטיס פיגמנטוזה

In this protocol, retinitis pigmentosa patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids were generated. Those organoids successfully recapitulated some clinical phenotypes of the retinitis pigmentosa disease.

יצירת אורגנואידים רשתית שמקורם ב-iPSC של מטופלים אנושיים למודל רטיניטיס פיגמנטוזה

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Medicine

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (PKG) pathway in photoreceptor cells causes photoreceptor cell death, especially in models harboring phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutations. Previous studies on RD have used mainly murine models such as rd1 or rd10 mice. Given the genetic and physiological differences between mice and humans, it is important to understand to which extent the retinas of primates and rodents are comparable. Macaques share a high level of genetic similarity with humans. Therefore, wild-type macaques (aged 1-3 years) were selected for the in vitro culture of retinal explants that included the retina-retinal pigment epithelium (RPE)-choroid complex. These explants were treated with different concentrations of the PDE6 inhibitor zaprinast to induce the cGMP-PKG signaling pathway and simulate RD pathogenesis. cGMP accumulation and cell death in primate retinal explants were subsequently verified using immunofluorescence and the TUNEL assay. The primate retinal model established in this study may serve for relevant and effective studies into the mechanisms of cGMP-PKG-dependent RD, as well as for the development of future treatment approaches.

Retinal explants obtained from wild-type macaques were cultured in vitro. Retinal degeneration and the cGMP-PKG signaling pathway was induced using the PDE6 inhibitor zaprinast. cGMP accumulation in the explants at different zaprinast concentrations was verified using immunofluorescence.

תרביות צמחי רשתית אורגנוטיפיים מקופי מקוק

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

אפיון ודינמיקה מורפולוגית של RPE מורין ראשוני מתורבת

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

מחבר זרקור: בידוד יעיל של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים מעכברים בוגרים לחקר רטינופתיה

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרבות Organotypic של הרשתית מלא עובי למבוגרים חזירי

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית

יצירת אורגנואידים רשתית שמקורם ב-iPSC של מטופלים אנושיים למודל רטיניטיס פיגמנטוזה

יצירת אורגנואידים רשתית שמקורם ב-iPSC של מטופלים אנושיים למודל רטיניטיס פיגמנטוזה

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

תרביות צמחי רשתית אורגנוטיפיים מקופי מקוק

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים