בחלקיק זה, אנו מציגים פלטפורמת התחדשות במבחנה המחקה את סביבת השומנים של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. פלטפורמה זו יכולה לשמש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של היתוך קרום פנימי מיטוכונדריה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת חקירה כמותית של חלבוני קרום אינטגרליים וחלבונים הקשורים לממברנה בסביבה כמעט ילידית.
כדי להתחיל, לערבב פתרונות A ו- B על פי הוראות כתב יד, ולאחר מכן ליצור את תערובת השומנים על ידי הוספת נפח מחושב של פתרון אחסון לתוך בקבוקונים ענבר עם מזרק זכוכית. התאם את עוצמת הקול הסופית על-ידי הוספת כלורופורם נוסף לבקבוקונים. אופים מגלשות כיסוי מיקרוסקופ ב 520 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר האפייה, מקררים אותם לטמפרטורת החדר. מוסיפים כ 10 גרם של נתרן הידרוקסידי ל 500 מיליליטר של מתנול תוך ערבוב. מערבבים במשך שעתיים, ממשיכים להוסיף נתרן הידרוקסידי לפתרון עד שהמשקעים מתחילים להראות.
נקו את מגלשות הזכוכית בתווית דודיציל סולפט של 10%, מתנול רווי נתרן הידרוקסידי וחומצה הידרוכלורית 50 מילימולרית, באמבטיה רציפה המנקה את המגלשות בכל תנאי למשך 30 דקות. נקה את מגלשות הזכוכית במים אולטרה-חמים במשך 10 דקות בין כל תנאי. אחסן את הכיסוי הנקי האטום בתתווית חומצה הידרוכלורית למשך עד שבועיים כדי להבטיח איכות דו שכבתית טובה.
נקו את שוקת הפוליטטרה-שפעת-אתילן של מערכת הטבילה Langmuir-Blodgett באמצעות כלורופורם ומים אולטרה-פלורים עד שלא נצפתה הרטבה. לרסס כלורופורם על פני השוקת ולנגב אותו ביסודיות שלוש פעמים עם מגבונים תאית, ולאחר מכן לשטוף אותו שלוש פעמים עם מים אולטרה פלור ולהסיר את המים באמצעות יניקה. בסיום, מכסים את פני השוקת במים אולטרה-חמים נקיים.
קח שתי חתיכות של משטח מטופל coverglass מתסכולת הניקוי ולשטוף אותם עם מים אולטרה חוץ במשך כ 30 שניות. הנח את הכריכה באופן גב אל גב באמצעות מהדק המצע כדי להחזיק את מגלשות הזכוכית. לטבול את החלקת הזכוכית מתחת לפני המים על ידי לחיצה ידנית dipper למטה על מערכת הבקרה Langmuir.
אפס את מאזן הסרט ולהפיץ בזהירות פתרון B טיפה אחר טיפה בממשק מי האוויר. ודא שומנים מתפשטים רק בממשק מי האוויר ללא טיפות כלורופורם ושומנים שוקעים לתחתית פני השטח polytetrafluoroethylene, אשר תיצור ערוץ השומנים ולמנוע היווצרות monolayer. להפסיק להוסיף שומנים כאשר הקריאה איזון הסרט הוא סביב 15 עד 20 מיליניוטון למטר.
המתן 10 עד 15 דקות ולאחר מכן ליזום את בקר המחסום כדי לשנות את שטח הפנים על ידי לחיצה על להתחיל ניסוי. המתן עד שקריאת מאזן הסרטים תגדל ל-37 מיליניוטון למטר ותשמור על הלחץ למשך כ-20 עד 30 דקות. הרם את הכיסוי במהירות של 22 מילימטרים לדקה תוך שמירה על מתח פני השטח במהירות של 37 מילניטון למטר.
מונוליאר השומנים עם קשירת פולימר יועבר מממשק מי האוויר אל פני השטח של coverglass דרך תהליך הטבילה Blodgett, ויוצרים את העלון התחתון של השומנים דו שכבתי. נקה את ממשק מי האוויר על ידי יניקה ולשטוף את השוקת עם מים אולטרה שופך. לאחר ניקוי מגלשת זכוכית חד-היטב עם כלורופורם, אתנול ומים אולטרה-חמים, מניחים אותה על השוקת שמתחת לשכבת המים.
ודא כי באר פונה כלפי מעלה לכיוון ממשק מי האוויר ויוצקים מים אולטרה-חמים טריים עד מגלשת הזכוכית מכוסה במלואה, ולאחר מכן לטבול את מגלשת הזכוכית מתחת לפני המים כפי שתואר קודם לכן. החזק את coverglass עם monolayer השומנים באמצעות יניקה סיליקון בעדינות לדחוף את monolayer השומנים לממשק מי האוויר. החזק את זכוכית הכיסוי למשך שתיים עד שלוש שניות בממשק ולאחר מכן דחוף אותה כנגד השקופית.
תוציא את המגלשה עם הכריכה. קחו את הכריכה ואת הדו-שכבתי למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי ודמיין את השומנים דו-שכבתיים בהתאם לכיווני כתב היד של הטקסט. מכינים צלחת התגבשות המכילה מים אולטרה-חמים ומ מניחים טבעת תמונת מיקרוסקופ נקייה מתחת לצלחת.
לטבול את השקופית ואת coverglass המכילים את השומנים דו שכבה מתחת למים. הפרד בעדינות את השקופית ואת הכיסוי, החזק את החלקת הכריכה מלמטה והעבר את כיסוי המשקפיים לטבעת התמונה. החלף את המים האולטרה-פלורים בטבעת התמונה במאגר נתרן כלוריד ביס-טריס, ודא שהשכבה הדו-שכבתית של השומנים אינה חשופה לבועות אוויר כלשהן.
הוסף 1.1 ננו-מולאר n-אוקטיל-בטא-glucopyranoside לשכבה הדו-שכבתית השומנים, ולאחר מכן מיד להוסיף את התערובת של 1.2 ננו-מולאר DDM ו 1.3 picomoles של L-OPA1 מטוהרים לתוך טבעת התמונה. דגירה המדגם על שייקר ספסל העליון במהירות נמוכה במשך שעתיים. להפיץ 30 מיליגרם SM-2 שושף חרוזים לתוך שלושה מיליליטר של חיץ ביס-טריס ולנער.
השתמש פיפטה פלסטיק להוסיף 5 עד 10 microliters של חרוזים SM-2 שף לטבעת התמונה דגירה אותו במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף את גם. אמצעי האחסון הסופי של המאגר בטבעת התמונה צריך להיות 1.5 מיליליטר. מכינים מיליגרם אחד של תערובת שומנים A בתספורם כלורופורם, ואז להתאדות כלורופורם תחת זרימת חנקן במשך 20 דקות.
שמור את התערובת תחת ואקום לילה כדי ליצור סרט השומנים. להכין 50 מילימולר סידן המכיל חיץ על ידי המסת 15.56 גרם של קלצין ב 50 מיליליטר של 1.5 תמיסת נתרן הידרוקסיד טוחנת. מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר עד קלצ'ין מומס לחלוטין.
הוסף 12.5 מילימולרים ביס-טריס ומים אולטרה-חיים לנפח סופי של 500 מיליליטר והתאם את ה- pH ל- 7.5. לוותר על סרט השומנים בקלצין המכיל חיץ, ולאחר מכן לחות את השומנים באופן מלא על ידי חימום ההשעיה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. טופס 200 ליפוזומים ננומטר באמצעות שבלט עם קרום פוליקרבונט.
הוסף שני מיקרוגרם של L-OPA1 ב 0.5 micromolar DDM, 2.2 מיליגרם ליפוזום דגירה הפתרון בארבע מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. הסר את החומר הדיאליזה על ידי דיאליזה עם קלטת דיאליזה 3.5 קילודלטון נגד 250 מיליליטר של 25 מילימולרים ביס-טריס, 150 מילימולר נתרן כלורי, ו 50 מילימולר חיץ סידן בארבע מעלות צלזיוס לילה, שינוי החיץ פעמיים. הסר קלסין נוסף באמצעות עמודת התפלה PD10, ולאחר מכן המשך עם הדמיה וניתוח נתונים כמתואר בכתב היד של הטקסט.
תמונות מיקרוסקופיה Epifluorescence של שומנים דו שכבתיים נזילות השומנים שלה מוצגים כאן. התפלגות השומנים מוצגת לפני ואחרי הלבנת תמונות וההומוגניות מוצגת לפני ואחרי ההלבנה מחדש. L-OPA1 מחדש ושומנים דו שכבה אומתה על ידי ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי או FCS.
עקומות FCS הצביעו על כך ש-75% מ- L-OPA1 שוחזר לתוך שכבת השומנים הדו-שכבתית, דבר המצביע על כך ש- L-OPA1 מתפזר בחופשיות בשכבת השומנים הפולימרית עם פוטנציאל להרכבה עצמית למתחמים פונקציונליים. הלבנת צעדים פלואורסצנטיים הצביעה על כך שממוצע של שניים עד שלושה עותקים של L-OPA1 שוחזרו בליפוזום נתון. התפלגות הגודל של פרוטאוליפוזום משוחזר L-OPA1 נבדקה לאחר התחדשות באמצעות DLS ואומתה באמצעות FCS.
קשירת קרום היה במעקב על ידי התבוננות האות של טקסס אדום על פני השטח של השומנים דו שכבתי באמצעות מיקרוסקופ TIRF. ממברנה השומנים דה ערבוב או hemifusion היה במעקב דרך טקסס אדום כמו סמן ליפוזום מפוזר לתוך השומנים דו שכבתי. Calcein de-quenching עזר להבחין היווצרות נקבוביות היתוך מלא רק ליפיד דה ערבוב, המאפשר השוואה בין תנאים שבהם חלקיקים לעכב ב hemifusion וחלקיקים להמשיך היתוך מלא.
קשירת ממברנה הצביעה על ידי אות שומנים יציב מליפוזומים ואות התפכחויות לא כללה דה-מרווה באות הקלצין, אך ריקבון מהיר של האות האדום של טקסס הצביע על דיפוזיה של הצבע לתוך השומנים הדו-שכבתיים. היתוך מלא כלל הן ריקבון השומנים והן שחרור תוכן. כאשר מנסים את החלקיק הזה, זכור לנקות ביסודיות הן את coverglass ואת שוקת Langmuir כדי להבטיח דו שכבות באיכות גבוהה מפוברקים.
איכות אוויר טובה היא גם קריטית כדי למנוע פגמים דו שכבתי. טכניקה זו סוללת לנו את הדרך לחקור שאלות חדשות בדינמיקה של קרום המיטוכונדריה ובארגון. ניסוי עתידי מרגש כולל חקירת ההשפעה של א-סימטריה דו-שכבתית, פוטנציאל קרום ומוטנטים הקשורים למחלות בדינמיקה של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה.
