שיטה זו מאפשרת לזהות בכל מקום חלבון CENP-A המתויג ב-EYFP. זה יכול להיות מיושם גם על חלבון CENP-A אנושי עם בדיקות שונות וחלבונים אחרים. היתרון העיקרי של זה הוא שניתן להשתמש בו כדי לזהות אתרים EYFP CENP-A K124R בכל מקום עם משמעות ביולוגית מכרעת.
זה יכול להיות מורחב כדי לחקור את השינויים שלאחר התרגום של מגוון רחב של חלבונים פונקציונליים. התחל בהכנת חלבון חרוזים הקשורים בנוגדנים נגד GFP. לשטוף 25 microliters של חלבון חרוזים לכל תגובת immunoprecipitation עם חיץ A1 לפחות שלוש פעמים כדי להסיר את האתנול.
לאחר מכן הפוך פתרון 50%חרוז עם מאגר A1. הוסיפו שני מיקרוליטרים של נוגדנים נגד GFP לחדדים. לאחר מכן הוסף מאגר A1 עד פי 20 מאמצעי האחסון של חרוז הרשת. בצע סיבוב מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 18 שעות.
משך הזמן האופטימלי לסיבוב חייב להיקבע באופן אמפירי בהתבסס על יעילות האימונופרציפציה. לאחר הסיבוב, צנטריפוגה את חרוזים ב 100 פעמים g במשך דקה אחת ולהסיר את על טבעי מאוגד. הוסף מאגר A1 כדי ליצור פתרון של 50% של חרוזים ולהשתמש ב- 25 מיקרוליטרים של פתרון זה עבור כל תגובת immunoprecipitation.
כדי לבצע את immunoprecipitation, lyse תאים במאגר A1 באמצעות sonication והקפאה / הפשרה. למדוד ריכוזי חלבון ולנרמל את כמויות החלבון בין דגימות IP שונות. לאחר מכן הסר 5% מהדגימה מכל צינור כדי לפעול בדף SDS.
מערבבים את שאר ליזט עם 25 microliters של חלבון חרוזים הקשורים נוגדן נגד GFP ולבצע סיבוב מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 18 שעות. לאחר lysing תאים במאגר A וביצוע immunoprecipitation כפי שתואר קודם לכן, לשמור 10% של immunoprecipitants הכולל כדי לאשר EYFP CENP-A בכל מקום כדי לקבוע במדויק את המיקום של EYFP בכל מקום CENP-A. השתמש ב- 90% האחרים לניתוח ספקטרומטריית מסה.
הפעל את דגימת ספקטרומטריית המסה בג'ל חלבון 4-12% זמין מסחרית. לאחר מכן בצע כתמים כחולים קומאסיים ובלו את אזור ג'ל 50-70 קילודלטון לניתוח ספקטרומטריית מסה. קוביות כל פרוסת ג'ל לחתיכות קטנות ומ מניחים אותם בצינור חלבון נמוך 0.5 מיליליטר.
לשטוף את חתיכות ג'ל עם 100 microliters של 50% אצטוניטריל ב 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט. מערבולת אותם במשך 10-15 דקות. ואז לסובב אותם למטה ולהשליך את העל-טבעי.
לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את חתיכות ג'ל עם ספסל העליון ואקום concentrator במשך 30 דקות. הוסף 10 microliters של 10 ננוגרם לכל רצף microliter כיתה טריפסין ולתת חתיכות ג'ל rehydrate במשך חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט, בדיוק מספיק כדי לכסות את חתיכות ג'ל ולעכל אותם ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
למחרת, להעביר את העל-טבעי מתעכל לתוך צינור סיליקון 0.65 מיליליטר נקי ולהוסיף 50% אצטוניטריל ו 5% חומצה פורמית פתרון. וורטקס הדגימה במשך 10 דקות. ואז לסובב אותו ולהעביר את העל-טבעי לתוך צינור חילוץ.
רכז את הדגימה שוב לשני מיקרוליטרים. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של 3%אצטוניטריל ו-2% תותב חומצה פורמית. Vortex זה במשך 15 דקות ולסובב אותו למטה ב 16, 000 פעמים g במשך 30 דקות.
בצע רכישת נתוני MS עם LC-MS/MS באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם מכשיר ספקטרומטריית מסה. הזרק שמונה מיקרוליטרים של המדגם לעמוד כרומטוגרפיה נוזלית בשלב הפוך והפרד את הפפטידים עם שיפוע של 2-80% של ממס B תוך 60 דקות בעקבות הוראות כתב היד. אסוף נתוני ספקטרומטריית מסה באמצעות מצב רכישה תלוי נתונים.
פתח את התוכנה המסחרית כדי לנתח נתוני ספקטרומטריית מסה בשולחן העבודה. כדי להתחיל חיפוש חדש, לחץ על לחצן LC בתפריט העליון. לאחר מכן לחץ על לחצן הוספה כדי להעלות את קבצי הנתונים הגולמיים המקוריים של MS.
בחר מזהה חלבון אנושי בשיטת הפרגון כשיטת החיפוש במסד הנתונים וחפש בקבצי הנתונים הגולמיים המקוריים של MS מול מסד הנתונים של UniProt homo sapiens. בחר טריפסין כאנזים העיכול והגדר את שאר הפרמטרים לפי הוראות כתב היד. הזינו את שם קובץ התוצאות ולחצו על הלחצן 'שמור בשם' מימין לתפריט.
לאחר מכן בחר תיקיה לאחסון תוצאות החיפוש ולחץ על לחצן השמירה. לחץ על לחצן התהליך כדי להתחיל את החיפוש. לאחר סיום החיפוש, נתונים עם שם החיפוש שהוזן יאוחסנו באופן אוטומטי בתיקיה שנבחרה.
כדי להשיג ספקטרום MS/MS של כל פפטיד ספציפי, פתח את תוצאות החיפוש בתוכנה F.Then לחץ על החלבון ברשימת החלבונים בתפריט העליון ולחץ על הפפטיד בתפריט האמצעי. MS/MS של פפטיד זה יופיע בתחתית התפריט. כדי לייצא ולשמור את ספקטרום MS/MS, העתק את הספקטרום והדבק אותו בתבנית קובץ מתאימה.
מבני גנים של EYFP CENP-A סוג פראי או מוטציה K124R אשר מציל את אובדן CENP-A אנדוגני באו לידי ביטוי באופן הדוק כאשר אינטגרציה רטרו-ויראלית בוצעה. הביטוי של CENP-A אנדוגני לא זוהה שבעה ימים לאחר אינדוקציה של Recombinase Cre. הן סוג הבר EYFP CENP-A והן ביטוי החלבון K124R נמצאו ברמה דומה לחלבון CENP-A האנדוגניים הראשוני.
הן EYFP CENP-A סוג פראי מוטציות K124R הראו לוקליזציה centromere בשבעה ימים לאחר שיבוש הביטוי הנותר של CENP-A אנדוגני. סוג הפרא EYFP CENP-A והמוטנט K124R הראו בכל מקום ואינטראקציה עם HJURP שלא כמו במקרה של סוג פראי מסומן או לא מתויג CENP-A ומוטנט K124R. הכדאיות התא הוערכה על ידי ביצוע המושבה להעריך 14 ימים לאחר ההפרעה של אלל CENP-A אנדוגני הנותרים.
שניהם EYFP CENP-A סוג פראי מוטציות K124R הראו מספר דומה של מושבות שניצלו 14 ימים לאחר ההפרעה של אלל CENP-A אנדוגני הנותרים. ספקטרומטריית מסה IP חשפה בכל מקום בליסין 306 ב- EYFP CENP-A K124R בתאי CENP-A מינוס F. בסך הכל, תוצאות אלה הראו כי היתוך של חלבון בגודל גדול גורם בכל מקום בליזין אחר מאשר K124R ב CENP-A אשר מעכב את פנוטיפ מוטציה יחיד K124R המקורי.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, השתמש בג'ל החלבון 4%12%Bis-Tris הזמין מסחרית כדי להפעיל את דגימות ספקטרומטריית המסה. מוסיפים מספיק טריפסין לחתיכות הג'ל ומייבשים אותם מחדש עד שכל האנזימים נספגים. תיוג משקל מולקולרי נמוך יותר או טכניקת בדיקה נדרשת למעשה כדי לדמיין בכל מקום ולחקור חלבון זמני מרחבי בכל מקום איתות ברמות האורגניזם כולו.
