מודל של מחלות לב איסכמיות והשוואה מבוססת וידאו של התכווצות קרדיומיוציטים באמצעות קרדיומיוציטים נגזר hiPSC

מחקר מחלות לב מבוצע לעתים קרובות בקטנים ויונקים כגון מכרסמים. עם זאת, הפיזיולוגיה של הלב האנושי שונה באופן משמעותי מזה של לב המכרסם. הפרוטוקול שלנו משתמש בקרדיומיוציטים המובדלים מתאים אנושיים של IPS כדי ליצור מודל למחלות לב איסכמיות ולכמת את הנזק והפגיעה התפקודית של קרדיומיוציטים איסכמיים.

פרוטוקול זה עשוי לספק שיטה נוחה להקרנת תרופות מותאמות אישית באמצעות תאי iPS הנגזרים מחולים בודדים, הטיפול המתאים בתאי IPS, כגון שימוש במדיום טרי, ושינוי המדיום לאט ובדייקנות הוא קריטי להבטחת התבלטות מוצלחת לקרדיומיוציטים תפקודיים. הדגמת ההליך עם יון ליו, יין ליאנג ומנגקסו וואנג יהיה צ'ן וואנג, דוקטורנט ממעבדה. כדי לגרום להתמדה של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם לתאי לב, ראשית מצפים את הבאר של צלחת תרבות באר 96 עם 100 מיקרוליטרים של 1.675 מיקרוגרם למיליליטר של למינין ב- PBS.

לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לראות שלוש פעמים 10 לתאי הגזע הרביעי ב 200 microliters של אמצעי תחזוקה IPS בתוספת 10 micromolar Y27632 לתוך כל באר, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא. לאחר 24 שעות, החלף את אמצעי העל ב-200 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה של IPS ל הבאר, והחזר את הלוחית לאנקובטור לתרבות התאים למשך יומיים-שלושה נוספים. כאשר התאים מגיעים ל- 70 עד 80%confluency.

החלף את המדיום בכל באר עם 200 microliters של אמצעי התברות מחומם מראש A ולהחזיר את הצלחת לחממה תרבות התא עוד 48 שעות. בסוף האינקובציה החליף לאט את העל-טבעי בכל באר עם 200 מיקרוליטרים של בידול מחומם מראש בינוני B והחזיר את הצלחת לחממה לתרבות התאים. לאחר יומיים, החליפו את העל-טבעיים ב-200 מיקרוליטרים של מדיום תחזוקה קרדיומיוציט מחומם מראש ל הבאר והחזירו את הצלחת לחממת תרבות התאים למשך עד 30 יום.

כדי להעריך את ההתכווצות של cardiomyocytes, להתקין את תמונת החלקיקים velocimetry תמונה j תוסף ולהשתמש מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ואת המטרה מזלגות להקליט תמונות וידאו של התאים בערך 20 מסגרות לשנייה במשך כ 10 שניות. לאחר מכן שמור את קובץ הווידאו כפי שניתח את ה- API שלנו וצור מבנה תיקיות כמצוין. כדי לנתח שדות וקטוריים דו מימדיים דיסקרטיים של תזוזה סלולרית, הפעל VG ובחר תוספים, פקודות מאקרו וערוך כדי לפתוח ניתוח וקטורי.

ijm, ולאחר מכן לחץ על הפעל את הניתוח תבוצע באופן אוטומטי. לטיפול איסכמי, החלף את העל-טבעי בכל באר ב-200 מיקרוליטרים של dmem ללא גלוקוז וסרום, ולאחר מכן הנח את הצלחת בתא היפוקסי ואז החדר גז חנקן לתא, תוך שמירה על ריכוז החמצן הפנימי ב-2% ועל ריכוז הפחמן הדו-חמצני ב-5% למשך 24 שעות. תאים מובחנים בהצלחה, מדגים התכווצות ספונטנית כפי שנצפה תחת המיקרוסקופ עם 50% מ בארות התרבות בדרך כלל מפגינים התכווצות ספונטנית בפחות מ -20 יום.

חלבון סמן לב יכול לשמש גם כדי לאשר התבלטות מוצלחת תאים מהקבוצה האיסכמי בדרך כלל להפגין כדאיות נמוכה יותר בבדיקת MTT, והתכווצות נמוכה יותר מאשר אלה של קבוצת הביקורת הנורמוקסית. היחס בין תאים חיוביים פרופידיום יודיד הוא גם גבוה יותר בקבוצה איסכמי, מאשר בקבוצת הביקורת, המציין שכיחות גבוהה יותר של נזק תאי. חשוב שתאתר במדויק את אזורי העניין בצלחת הלכידה כדי לאפשר השוואה של התכווצות הקרדיומיוציטים.

טכניקה זו יכולה לשמש להקרנת סמים, באמצעות תאי iPS שמקורם בחולה. הוא גם מספק פלטפורמה ייחודית להבהרה נוספת של המנגנונים שבבסיס מחלות לב איסכמיות