פרוטוקול תפוקה גבוה זה מאפשר סינון מהיר של שתילי עגבניות מגישה פראית למזרק פסאודומונס פתוגן חיידקי. מבדיקה של שיטפון השתילים ממזערת את זמן צמיחת הצמחים ואת צרכי תא הצמיחה, מאפשרת תחלופה מהירה של צמחים ומאפשרת נבדקים גדלי מדגם גדולים. בדיקה זו היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לסנן התנגדות בגישה פראית וקווים אחרים עם רקע גנטי מורכב.
הפרוטוקול מספק כיוונים ספציפיים להזרקת שיטפונות של שני זנים מזרק Pseudomonas. עם זאת, הוא רב תכליתי ו ניתן לשנות כדי לזהות עמידות המארח פתוגנים חיידקיים אחרים. הדגימה להליך תהיה יאנה חסן, מומחית מחקר במעבדה שלי.
התחל בגידול שתילי העגבניות. מניחים זרעי עגבניות בצינור מיקרוצנטריפוגה 2.2 מיליליטר ומוסיפים שני מיליליטר של 50% פתרון אקונומיקה. רוק הצינור במשך 25 דקות ולאחר מכן להסיר את הפתרון אקונומיקה עם פיפטה.
מוסיפים שני מיליליטר של מים טהורים במיוחד ושוטפים את הזרעים על ידי היפוך הצינור חמש פעמים. שאפו את הנוזל מהצינור, וחזרו על הכביסה ארבע פעמים נוספות. לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים שני מיליליטר של מים טהורים במיוחד ויוצקים את הזרעים לתוך צלחת פטרי סטרילית.
סטריליזציה ממטרים על ידי בוער אותם באתנול ואז להשתמש בהם כדי להעביר חמישה עד שבעה זרעים על צלחת 100 על ידי 25 מיליליטר עם 0.5 XMS בתוספת 0.8 אחוז אגר מדיה. לאטום את הקצוות של הצלחת עם קלטת כירורגית. ודא כי הצלחות מוערמות שטוחות עם הפנים כלפי מעלה.
מרביים את הזרעים הסטריליים בארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים לפחות כדי לסנכרן נביטה. לאחר שלושה ימים, מכוונים אנכית את הצלחות כך שהשורשים יגדלו לאורך פני השטח של הצלחת וקו הזרעים מכוון אופקית. מעבירים את הזרעים לתא צמיחה שנקבע ל-22 מעלות צלזיוס עם מחזור חושך של 16 שעות, 8 שעות.
לגדל את השתילים במשך עשרה ימים בתא, ובנקודה זו הם בדרך כלל יציגו קוטילדונים מגיחים ומורחבים ועלים אמיתיים ראשונים. פס חיידקים טריים על אגר KB מתאים עם קיסם שטוח, סטרילי. עבור PstT1, דגירה הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפני השימוש בחיידקים בניסוי השיטפון.
כדי להכין את inoculum, באופן בלתי ניתן לחישוב מחדש את החיידקים סטרילי, עשרה מילימולר מגנזיום כלורי לצפיפות אופטית של 0.1. לאחר מכן לבצע שני דיללולים סדרתיים כדי לקבל ריכוז עבודה עם OD600 של 0075. כמו כן להכין אחד עד עשרה דילול של קופולימר פעילי שטח שאינם יוניים במגנזיום כלוריד 10 מילימולאר.
מערבולת זה ולהוסיף אותו לחיידקים, מערבולת הצינור לערבב. מעבירים את הצלחות עם השתילים בני עשרת הימים מתא הגדילה לארון האבטחה הביולוגית ומסירים את הקלטת הכירורגית. ואז להעביר שישה מיליליטר של inoculum לכל צלחת.
בעדינות לדחוף את השתילים לתוך inoculum עם קצה פיפטה ולהתחיל טיימר במשך שלוש דקות. החזיקו צלחת אחת בכל יד והטו את חזית הצלחת כלפי מטה כדי להטביע את הקוטילדונים ועלי השתילים. סוויש את inoculum מצד לצד חמש עד שבע פעמים, ואז להטות את הצלחות בחזרה כדי לכסות את השורשים עם inoculum.
להטות את הצלחות שוב למטה ולחזור על המחזור במשך שלוש דקות בסך הכל. יוצקים את inoculum את הצלחות, להגדיר אותם על משטח שטוח, ויוצקים את כל inoculum שיורית בפעם השנייה. לעטוף מחדש את הצלחות ולמקום אותם בחזרה בתא הצמיחה.
Moneymaker-PtoR ו Moneymaker-PtoS זנים הוצפו PSTDC3000 ו פנוטיפים שבעה עד עשרה ימים לאחר הצפה. שתילים Moneymaker-PtoR לשאת את אשכול הגנים PtoPRF היו עמידים PSTDC3000. בעוד כמעט איזוגני Moneymaker-PtoS שתילים, אשר לא יכול לזהות את PSTDC3000 משפיעים AVRPto או AVRPto-B מת במהירות, בתוך שבעה ימים לאחר הצפה.
שתילים בני עשרה ימים הוצפו ב- PstT1 ובפנוטיפים לפחות עשרה ימים לאחר ההצפה. זיצויים רגישים היו מתים, היו להם מריסטמים אפים חומים וחסרו צמיחה חדשה. לעומת זאת, שתילים עמידים הציגו רמה גבוהה של צמיחה ירוקה חדשה ושרדו זיהום עם PstT1.
בדיקות גידול חיידקים בוצעו כדי לאשר כמותית עמידות PstT1 ו Solanum NeoRici LA1329. היה הבדל של 1.7 ביומן הצמיחה החיידקית בין LA1329 עמידים רגישים הבדל יומן 1.6 בין LA1329 עמיד Moneymaker-PtoS, אשר בקורלציה עם התוצאות פנוטיפיות. בעת ביצוע בדיקה זו, הדברים החשובים ביותר לזכור הם לשים לב לטכניקה aseptic לאורך כל הפרוטוקול ולהבטיח כי כל השתילים על הצלחת מוצפים ביסודיות.
הקפד autoclave רקמת צמח נגועים וחיידקים להיפטר מחומרים בהתאם לתקנות המתאימות.
