זרימת עבודה זו של פרוטומיקה מאפשרת זיהוי ומיפוי בלתי משוחדים של אינטראקציות אנדוגניות של חלבוני חלבון עם רזולוציה תת-תאית. טכניקה זו היא יתרון במיוחד בעת חקירת חלבוני פיתיון רגישים מינון, שפע נמוך, או יש לוקליזציה subcellular מרובים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מיפוי אינטראקציות חלבון אנדוגני בהנחה שיש reagent זיקה מתאים זמין.
זה חשוב במיוחד עבור רבים מאלפי חלבונים בעלי תפקוד לא ידוע, שרבים מהם קושרו עם מחלה אנושית. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל קו תא או רקמה נוחה שבר תת תאי. כל חלבון עם זיקה מתאימה יכול להיות ממוקד.
תוצאה נפוצה עבור ניסויי טיהור זיקה היא לעתים קרובות אין תוצאה. רייגנטים ממש טובים, איסוף נתוני QC לאורך כל הדרך והגבלת הטיפול בדגמים הם כולם חשובים באמת. דע שיש לך דגימה.
כדי להתחיל, להפשיר את כדורי התא מוכן במשך 15 דקות בנפח גלולה 1X של חיץ קר A עם מעכבי פרוטאז או מעכבי פוספטאז. מניחים את הצינור המכיל את גלולת התא על מטור בארבע מעלות צלזיוס כדי לסייע בהקפאה במשך 30 דקות. ואז למקם את הצינור בצנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה.
Decant supernatant ו resuspend התאים עם 5X נפח התא ארוז עם חיץ A.Incubate על הקרח במשך 20 דקות. לאחר מכן, גלולה שוב ב 2, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. Decant המאגר ולתלות מחדש עם חיץ נפח תא ארוז 2X A עם מעכבי פרוטאז או מעכבי פוספטאז.
לנקום בערך שבע פעמים עם העלי הרופף A.צנטריפוגה lysate במשך 10 דקות ב 2, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. מעבירים בזהירות את העל-טבעי לצינור חדש ומקפיאים אותו בחנקן נוזלי. אחסן את הלט במינוס 80 מעלות צלזיוס.
יש לחדש את גלולה עם נפח גלולה 0.9X של חיץ B עם מעכבי פרוטאז או מעכבי פוספטאז ולערבב על מגוז במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי ללקט את הגרעינים, יש לשטוף 20 פעמים עם העלי הטיטר B.Mix את הלסת הגרעינית על מטור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, כך שהוא הומוגני. ואז צנטריפוגה ליאזט גרעיני במשך 30 דקות ב 21, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס.
פיפטה את supernatant ולשמור כמו תמצית חלבון גרעיני מסיס. כדי דיאליזה תמצית גרעינית מסיסים, הראשון לחתוך אורך מתאים של צינורות דיאליזה ברוחב 24 מילימטר עם ניתוק משקל מולקולרי של שמונה קילודלטון. מהדקים צד אחד של הצינורות ומטעין את הגרעין לתוך הצינורות.
לאחר טעינת ליסאט, מהדקים את הקצה השני וצוללים לתוך מיכל זכוכית נקי המכיל חיץ C עם מעכבי פרוטאז. דיאליזה במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להעביר את הגרעין תמצית גרעינית דיאליזה לתוך צינור צנטריפוגה ב 21, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
העבר שלושה 20 aliquots microliter של התמצית הגרעינית לצינורות microcentrifuge חדשים עבור אימות שבר על ידי כתם מערבי. באמצעות טיפים פיפטה שנחתכו בקצה, להכין תערובת חלבון A / G חרוזים עבור כל לשכפל על ידי שילוב 12.5 נפח חרוז מיקרוליטר של חלבון A Sepharose עם 12.5 microliters של חלבון G Sepharose בצינורות מיקרו צנטריפוגה. לשטוף את תערובת חלבון A / G חרוזים פעמיים עם 300 microliters של חיץ IP I.Spin את חרוזים ב 1, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת decant החיץ.
לאחר מכן, הכינו את חרוזי A/G של חלבון הנוגדנים. כדי לקשור את הנוגדן ל חרוזים, להוסיף לצינור 300 microliters של מאגר IP אני ו 10 מיקרוגרם של הנוגדן הרצוי. אפשר לתערובת הנוגדנים של חרוזים להתנודד על מטור ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
עכשיו aliquot כרכים מתאימים של lysates הגרעיני לתוך צינורות microcentrifuge שימור נמוך עבור מיליגרם אחד של קלט חלבון לכל לשכפל. לסובב את lysate ב 16, 000 פעמים g במשך 30 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש. מוסיפים מיקרוליטר אחד של בנזונז ב 250 יחידות למיקרוליטר עבור כל מיליגרם של lysate הגרעיני סלע על nutator בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 עד 15 דקות.
כדי להכין חרוזים לפני ניקוי lysate, להוסיף 12.5 microliters של כל חלבון A וחרוזי חלבון G ל 1.5 צינורות שימור נמוך מיליליטר. לשטוף פעמיים עם חיץ שטיפת IP אני עם מעכבי פרוטאז. תדקיק את החיץ ותוסיף מיליגרם אחד של ליסט הגרעין המוכן ל חרוזים.
אינקובט תוך נדנדה על מטור במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה lysates מראש פינה ב 1, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן לשטוף את חלבון הנוגדן A או G חרוזים פעמיים עם חיץ IP אני עם מעכבי פרוטאז.
לאחר צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת, decant החיץ. עכשיו להעביר את lysate גרעיני נוקה מראש על חלבון הנוגדן A או G חרוזים. אינקובט תוך נדנדה על מטור ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות.
בעקבות הדגירה, צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. העבר את העל-טבעי לצינורות המסומן כזרימה עבור כל שכפול. לשטוף את חלבון הנוגדנים A או G חרוזים ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של חיץ IP II עם מעכבי פרוטאז.
ואז לשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ IP אני עם מעכבי פרוטאז. ודא שכל המאגר יוסר לאחר הכביסה האחרונה. חלבון Elute את חרוזים על ידי דגירה עם 20 microliters של 0.1 גליצין טוחן ב pH 2.75 כל אחד במשך 30 דקות על nutator.
ואז להסתובב ב 750 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת ואת פיפטה את העל טבעי. חזור על דגירה זו עם מאגר אלוטיון בפעם השנייה. לאחר הכנת גלולת החלבון, יש לתלות אותה מחדש ב-30 מיקרוליטרים של מאגר אלקליות SDS.
דגירה המדגם על בלוק חום 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. ואז לתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הוסף 300 מיליליטר של פתרון UA ו 30 microliters של 100 מילימולר TCEP לכל מדגם.
טען את הפתרון למסנן צנטריפוגלי של 30,000. לאחר סיבוב מסנן צנטריפוגלי ב 21, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, לשמור על הזרימה דרך במקרה שיש בעיה עם המסנן. לאחר שטיפת המסנן על פי כתב היד, להוסיף שלושה microliters של מיקרוגרם אחד לכל microliter lyse C resuspended ב 0.1 molar טריס pH 8.5.
מלא את המסננים עד לסימן 100 מיקרוליטר עם 0.1 טוחן טריס pH 8.5. אפשר לו לעכל במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס תוך נדנדה על מטור. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של מיקרוגרם אחד לכל טריפסין כיתה MS מיקרוליטר.
מערבבים בעדינות ומאפשרים לטרפסין להדגים עם המדגם לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך נדנדה על מטור. בבוקר, צנטריפוגה מספר פעמים ב 21, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות כדי לחמק פפטידים מהמסנן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה שימור נמוך נקי. לאחר התפלת הפפטידים באמצעות עמודי ספין C18, השתמשו מחדש בפפטידים ליופילים בשבעה מיקרוליטרים של 0.1% TFA ב-5% אצטוניטריל.
Sonicate את המדגם במשך שלוש דקות כדי להבטיח כי פפטידים כבר resuspended, ולאחר מכן להסתובב למטה ב 14, 000 פעמים g במשך 10 דקות. טען 15 עד 30% מהדגימה על מערכת ספקטרומטריית המסה של הכרומטוגרפיה הנוזלית לצורך ניתוח. במחקר זה, immunoprecipitations טריליקט נותחו מחמישה מיליגרם של תמצית גרעינית HeLa ניצול שליטה חרוז בלבד.
הפיתיון DYRK1A מדורג בין שלושת החלבונים המועשרים המובילים על פני השליטה אשר מציין את הניסוי IP-MS שבוצע היה אמין. הפרדה ברורה הוצגה בין האינטראקציה בביטחון גבוה לבין יותר מ -95% של חלבונים copurified זוהו לא ספציפי. לדוגמה, ערכת הנתונים DYRK1A, שותפי אינטראקציה של IREF הציגו ערכי FC-A הנמוכים מ- 0.45 המייצגים העשרה נמוכה מאוד על השליטה.
בהתאם לכך, רבות מהאינטראקציות שדווחו בעבר הן שליליות כוזבות בתוך ערכת נתונים זו על ידי ירידה מתחת לסף FC-A של שלוש. מספר העותק המוחלט המחושב של כל אינטראקציית IREF לא הראה מתאם לרמות הזיהוי של שותף אינטראקציה על-ידי IP-MS. השימוש המשולב של FC-A גדול משלושה קדושים יותר מ 0.9 הפחית את הרשימה של אינטראקציות ביטחון גבוה לשישה חלבונים.
עם זאת, בעת החלת ניתוק FC-A של יותר משלושה בבידוד, שמונה חלבונים נוספים נוספו לרשת. החלק המכריע ביותר של פרוטוקול זה הוא הבחירה של ריאגנט נוגדנים עבור immunoprecipitation. מומלץ לבצע אימות של סלקטיביות של כתמים מערביים או של קומאסי לפני השלמת זרימת עבודה זו.
עדות תומכת של אינטראקציות חלבון חלבון יכול להיות מתוך שיתוף IP המערבי סופג של אינטראקצינים מזוהים. קישור כימי חלבון, אם כי מורכב יותר, יכול לחשוף תחומי אינטראקציה של אינטראקציה. בשיטה זו, קבוצת המחקר שלי חשפה פונקציות חדשניות עבור DYRK1A, קינאז חלבון הנדרש להתפתחות המוח של יונקים ומקושר עם נוירופתולוגיה של מחלת אלצהיימר.
