זה עשוי לשמש כדי לעזור לענות על שאלות מפתח על איך לסנתז מולקולות DCAF עם נטרול נוגדנים ממוקד. טכניקה זו מספקת את הדרך הפשוטה ביותר לסנתז את מולקולות DCAF עם פרודוקטיביות גבוהה. העולם מחליט שלמולקולות DCAF יש את ההתערבויות הפוטנציאליות לנוגדן בעסקאות עם מחלות כמו קדחת דנגה ומיאסתניה גרוויס.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מולקולות DCAF אחרות עם אפיטופים שונים כדי למקד את נוגדני הקוגניציה. הדגמת ההליך תהיה שו באי, טכנאי בכיר מהמעבדה שלי. כדי להמיר 2-כלור שדון הידראזין נגזר 2-כלור שדון, מהחלק העליון של כלי סינתזת פפטיד, להוסיף חמישה מיליליטר של DMF כדי 0.25 מילימולים של 2-כלור שדון.
שים את הכובע בחזרה על, בעדינות לנער את הכלי במשך 15 שניות, ולאחר מכן לנקז אותו על דוכן ברזל. חזור על שטיפת DMF פעמיים נוספות. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של DCM לכלי, לשים את הכובע בחזרה על, בעדינות לנער את הכלי במשך 15 שניות, ולאחר מכן לנקז אותו על דוכן ברזל.
חזור על שטיפת DCM פעמיים נוספות ולאחר מכן חזור על שטיפת DMF שלוש פעמים נוספות. לאחר מכן, להוסיף שישה מיליליטר של 50% ריכוז נפח של DMF מעל DCM כדי להתנפח אתשרף במשך 30 דקות ולאחר מכן לנקז אותו. עכשיו להעביר שישה מיליליטר של 5% ריכוז נפח של הידראזין ו DMF לכלי התגובה.
מניחים אותו על השייקר ב 120 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן לנקז את הפתרון על ידי משאבת ואקום. כדי לטהר את הנגזרת ההידראזינית של פפטיד Fc-III, השתמש במערכת HPLC כדי לטהר את הפפטיד באלסטיון שיפוע של 30 דקות בקצב זרימה של מיליליטר לדקה. לאחר טיהור חלבון על פי כתב היד, להוסיף לתוך צינור חדש שני מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר SUMO מתויג חלבון, מיליליטר אחד של SUMO פרוטאז, מיליליטר אחד של חיץ פרוטאז 10X SUMO, ושישה מיליליטר של מים מזוקקים כפולים כדי להכין את פתרון התגובה.
דגירה את התערובת במשך 12 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס. ואז aliquot את התערובת לשמונה 1.5 צינורות Eppendorf מיליליטר, ו צנטריפוגה את התערובת ב 15, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש pipet כדי להשליך את הצבירה בתחתית, ולאחר מכן לתוך 10 מיליליטר פינה supernatants, להוסיף 0.5 מיליליטר של תרחיף 50% ניקל NTA חרוזים ב 50 מילימולאר PBS.
מניחים את הצינור בשייקר סיבובי ב 200 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס לערבב בעדינות במשך 60 דקות. לאחר מכן, לטעון את lisade ואת תערובת ניקל NTA לתוך עמודה עם מכסה שקע התחתון. הסר את המכסה התחתון ולשמור את הזרימה דרך לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
חלבון סומו התג שלו מחייב בעמודה. החלק אנטיגן מקשר, אשר מתחיל עם חבר העמים לתגובת קשירה כימית מקורית, הוא בזרימה דרך. עכשיו משקל 1.8 מיליגרם של נגזרת הידראזין של פפטיד Fc-III לתוך צינור Eppendorf שני מיליליטר ולהוסיף 0.8 מיליליטר של שישה כלוריד guanidinium טוחנות ב 0.2 פתרון מונוסודיום פוספט טוחנות ב pH 3.
מערבולת כדי להמיס את האבקה. לאחר צנטריפוגה הצינור ב 7, 200 פעמים G במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר להעביר את supernatant לתוך צינור חדש. מוסיפים בר ערבוב בצינור ומכניסים את הצינור לאמבט מלח קרח על תוך ערבוב מגנטי כדי להתסיס בעדינות את הפתרון במשך 15 דקות.
לאחר מכן להוסיף 40 microliters של 0.5 נתרן ניטריס טוחן לפתרון כדי לחמצן את הקבוצה הידראזין. בעדינות להתסיס את הפתרון עוד 15 דקות באמבט מלח קרח. לשקול ב 11 מיליגרם של HPLC מטוהרים להקפיא חלק אנטיגן מקשר מיובש, ו 13.6 מיליגרם של MPAA לתוך צינור התגובה באמבט מלח קרח.
מערבבים במשך חמש דקות ולאחר מכן להתאים את ערך ה- pH ל 6.8 עד 7.0 בחדר ממוזג עם שישה נתרן הידרוקסיד טוחן. השלב הקריטי ביותר עבור קשירה כימית מקורית היא להתאים את ערך ה- pH בזהירות כדי ליזום את תגובת הקשירה. לאחר 12 שעות באמבט מלח הקרח, מוסיפים 0.4 מיליליטר של 0.1 פתרון ניטרלי TCEP טוחן למערכת התגובה, ומערבבים במשך 20 דקות כדי לסיים את התגובה.
לאחר צנטריפוגה וטיהור HPLC, השג את שיא ההצדעה השלישי לדסולפוריזציה. ממיסים אותו ב 50 microliters של שישה גואנידיניום כלוריד טוחן בתמיסת מונוסודיום פוספט טוחן 0.2. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של TCEP טוחן אחד, 10 מיקרוליטרים של tert-Butylthiol, וחמישה מיקרוליטרים של 0.1 VAO טוחן לארבעה פתרוןים.
התאימו את ה-pH הסופי של הפתרון ל-6.9 ושמור את הפתרון על 37 מעלות צלזיוס על שייקר למשך כחמש שעות. צנטריפוגה ולטהר שוב. ממיסים את הפפטיד המוכן ב-200 מיקרוליטר של אצטט כסף 32 מילימולרים, ואז מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות.
כדי להמיר את thiolates כסף על פפטיד כדי thiols חינם, להוסיף שלושה microliters של DTT טוחנת אחת בשישה כלוריד guanidinium טוחנת, ו 0.2 מונוסודיום פוספט טוחנת ב pH 7. הפעילו את ספקטרומטר המסה במצב סריקה מלא והגדירו את טווח ה-m/z על 300 עד 2,000 ורזולוציה של 60,000. פתח את נתוני ספקטרום המסה ולמצוא את פסגות המוצר בכל שלב כדי לאשר את התגובה הכימית מבוצעת בהצלחה.
כדי לבצע בדיקת ELISA של האינטראקציה בין נוגדן DCAF1 ו- 4G2, מצפים כל באר של צלחת מיקרוטיטר 96 באר עם picomole אחד של נוגדן נגד GST ב 100 microliters של חיץ ציפוי. לאטום את הצלחת עם קלטות איטום דגירה אותו ב 4 מעלות צלזיוס לילה על שייקר. בבוקר לחסום כל באר עם 200 microliters של 1%BSA ו PBS.
לאטום את הצלחת ולהדרגר אותו חדר ממוזג במשך שעה על שייקר. לאחר מכן השתמש PBS עם 0.05% Tween 20 לשטוף כל באר ארבע פעמים. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשיטת הרצועה הכימית המקורית לסינתזה למחצה של מולקולת DCAF1.
ספקטרום המסה מראה שלמולקולת DCAF1 הסופית יש משקל מולקולרי דה-קונבנציונלי של 11, 053. במהלך בדיקת ELISA, אנטיגן פפטיד Fc-III ו DCAF1 באופן תחרותי לעכב 4G2 נוגדן מחייב. הן אנטיגן פפטיד ו DCAF1 חסם באופן משמעותי 4G2 מחייב ואילו פפטיט Fc-III לא השפיע על האינטראקציה נוגדן אנטיגן.
לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך להתערבות של מחלות הקשורות לנוגדנים מזיקים. לוט של האזורים המשמשים לסינתזת פפטיד ו קשירה כימית מקורית הם רעילים מאוד. הקפד לקחת את הניסויים האלה בשכונה הכימית שלך.
