השיטה שלנו היא אחת הראשונות להיות מסוגל לנתח את הבסיסים הגנטיים של הבדלי תכונות בקנה מידה גנום רחב בין מינים במקום בתוך מינים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שזה תפוקה גבוהה, רזולוציה גבוהה, וישים נרחב. כדי להתחיל בהליך זה, לאחזר את זן מלאי המקפיא JR507 מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס, ולפס אותו למושבות בודדות על צלחת אגר YPD.
דגירה ב 26 מעלות צלזיוס במשך יומיים או עד מושבות להופיע. ואז לחסן 100 מיליליטר של YPD נוזלי בבקבוק זכוכית 250 מיליליטר עם מושבה אחת של JR507, ו דגירה ב 28 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 200 סל"ד במשך 24 שעות או עד שלב נייח הוא הגיע. למחרת, למדוד את od600 של תרבות הלילה.
בחזרה לדלל חלק מתרבות הלילה עם YPD נוזלי טרי לתוך בקבוק ליטר אחד חדש כדי ליצור תרבות חדשה עם od600 של נקודת אפס שתיים ונפח של 500 מיליליטר. חזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות כדי ליצור סך של ארבע תרבויות עם od600 של נקודת אפס שתיים, באמצעות אותה תרבות לילה עבור כל התרבויות החדשות. הדגירה כל התרבויות ב 28 מעלות צלזיוס במשך שש שעות תוך רועד ב 200 סל"ד.
לאחר מכן, לשלב שתיים מתוך 500 תרבויות מיליליטר כדי ליצור תרבות ליטר אחד. שלב את שתי התרבויות הנותרות של 500 מיליליטר כדי ליצור תרבות שנייה של ליטר אחד. ראשית, לפצל כל אחת מתרבות ליטר אחד לתוך 20 50 aliquots מיליליטר כל אחד בצינור חרוט פלסטיק עבור סך של 40 צינורות.
מניחים בצד 20 צינורות. צנטריפוגה הנותרים 20 צינורות ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות כדי גלולה את תאי השמרים. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש כל גלולה עם 25 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת.
צנטריפוגה ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות. השלך את העל-טבעי, ולחץ מחדש על כל גלולה עם חמישה מיליליטר של נקודת האפס 1X טריס-EDTA אחד מאגר ליתיום אצטט Molar על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות.
השלך את העל-טבעי, ולחץ שוב על כל גלולה עם חמישה מיליליטר 1X טריס-EDTA נקודת אפס אחת מאגר ליתיום אצטט Molar על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות. בעוד התאים הם צנטריפוגה, להכין לפחות 120 מיליליטר של פתרון המכיל פוליאתילן גליקול, ליתיום אצטט, וחוצץ טריס-EDTA.
אחסן את הפתרון הזה בקרח. כדי להכין את ה-DNA פלזמה לשינוי, תחילה להרתיח ארבעה מיליליטר של DNA זרע סלמון ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, מיד לקרר אותו על קרח במשך חמש דקות.
מערבבים 20 מיליליטר של pJR487 בריכוז של 538 ננוגרם למיליליטר עם ארבעה מיליליטר של DNA זרע סלמון קר. שמור את התערובת על הקרח עד מוכן לשימוש. לאחר מכן, להוסיף 600 microliters של תערובת DNA פלזמה וזרע על גבי כל גלולה התא.
הוסף שלושה מיליליטר של תערובת ליתיום אצטט TE PEG לכל גלולה. אנחנו משהים על ידי צינור למעלה ולמטה ולאחר מכן מערבולת. דגירה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
ואז חום לזעזע כל צינור באמבט מים ב 39 מעלות צלזיוס במשך 26 דקות, הקפדה להפוך כל צינור כל כמה דקות. צנטריפוגה הצינורות ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש כל גלולה ב-10 מיליליטר של YPD על-ידי מערבולת.
לאחר מכן, לשלב את כל 20 צינורות לתוך בקבוק זכוכית חדש. הוסף 433 נקודה ארבעה מיליליטר של YPD נוזלי לתוך בקבוק זכוכית ליטר חדש. ואז להעביר 66 נקודה שישה מיליליטר של תאים לתוך הבקבוק.
חזור על תהליך העברה זה פעמיים נוספות כדי להשתמש בכל אמצעי האחסון של תאים שעברו שינוי צורה. ואז למדוד את od600 של כל תרבות חדשה 500 מיליליטר. דגירה כל שלוש התרבויות ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעתיים תוך טלטול ב 200 סל"ד.
לאחר מכן להוסיף נקודת אפס חמישה מיליליטר של 300 מיליגרם למיקרוליטר G418 לכל אחד מהבקבוקים לריכוז סופי של 300 מיקרוגרם למיליליטר. מחזירים את הבקבוקים לאנקובטור הרועד ב-28 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. חזור על כל התהליך הזה עם 20 צינורות חרוט הנותרים.
בשלב זה, צריך להיות שישה בקבוקונים ליטר אחד, כל אחד מכיל 500 מיליליטר של תאים עם G418 הוסיף. הדגירה כל ששת הבקבוקים ב 28 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך כיומיים או עד od600 של כשתי נקודות שלוש הוא הגיע בכל בקבוקון. לאחר מכן, לשלב את כל ששת flasks יחד כדי ליצור תרבות אחת.
השתמש בתרבות משולבת זו כדי לחסן שני בקבוקונים חדשים של ליטר אחד עם 500 מיליליטר של YPD ו- G418 ל- od600 של נקודת אפס שתיים. הדגירה תרבויות חדשות אלה לילה ב 28 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד עד שהוא מגיע od600 של כשתי נקודות שתיים. לאחר מכן, לשלב את שתי התרבויות לתרבות אחת, ולמדוד את od600 של התרבות המשולבת.
צנטריפוגה 25 מיליליטר של תרבות זו ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות. חשב את מספר יחידות התאים הכוללות של od600 ב- 25 מיליליטר כמפורט בפרוטוקול הטקסט. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים במספיק מים כדי ליצור השעיית תא עם od600 של נקודה אחת שמונה חמש למיליליטר.
באמצעות חמוזי זכוכית, צלחת מיליליטר אחד של תאים resuspended על כל אחד 12 גדול, מרובע להשלים צלחות אגר סינתטי עם 5-FOA. דגירה כל צלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך יום עד יומיים, או עד מדשאה נוצרת על הצלחת. לאחר מכן, השתמש חריקות סטריליות קטנות כדי לגרד את התאים של מחצית הצלחת, לתוך צינור, המכיל 35 מיליליטר של מים סטריליים.
חזור על תהליך זה עבור ששת הלוחות הנותרים, וכתוצאה מכך שני צינורות של תאים במים. שלב את מתלי התא לתוך בקבוקון יחיד, ולמדוד את od600 של ההשעיה, באמצעות מים כמו ריק. השתמש במים כדי להתאים את ריכוז התא עד od600 מגיע 44 נקודה ארבע למיליליטר.
לאחר מכן, הכינו מלאי תאים במקפיא ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, S.Cerevisiae ו S.Paradoxus הם mated כדי ליצור היברידית סטרילית, אשר נתון transpose על mutagenesis. כל שיבוט מוטגן הוא המיזיגוט, הכלאה דיפלואידית שבה אלל אחד של גן אחד משובש.
ההמיזיגוטים מתחרים בטמפרטורה גבוהה, והדנ"א מבודד מכל תרבות. הדנ"א מומר ומ וקשוב במתאמים, והצומת בין הטרנספוזון לגנום מוגבר עם פריימר ספציפי לטרנספוזון ו פריימר ספציפי למתאם. ספירת רצף בתפזורת ספירת קריאה מן האמפליקון, לדווח על הכושר של שיבוט באוכלוסייה.
עם התוצאות ביד מן רצף זה, שפע hemizygote עבור גן נתון, ניתן להשוות בשתי הטמפרטורות בין שתי מחלקות של hemizygotes. שיבוטים שבהם רק ה-S.Cerevisiae allele היה פראי ופונקציונלי, ושיבוטים הסתמכו רק על אלל ס. פרדוקסוס. ביישום מייצג זה, אותות חזקים מזוהים בשמונה גנים של משק בית.
בכל מקרה, הכנסות טרנספוזון ב- S.Cerevisiae allele בהיברידית, צמיחה בסכנה בטמפרטורה גבוהה. אלה מיוצגים נמוך si דטרמיננטים מועמדים של התכונה thermotolerance המבדיל S.Cerevisiae מ S.Paradoxus. עכשיו שהשלמנו את הניסוי הזה, אנחנו יכולים לנתח תכונות אחרות השונות בין המינים האלה, כמו סובלנות קרה או מלח.
