בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים בהידרציה מחדש של סרטים גם כדי ליצור תאי תגובה עשויים פפטידים. בניסויים, אנו נהנים מהפשטות והחזקה של הפרוטוקול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לשלב אפילו דגימות רגישות, כגון תמצית תאים גולמיים בשימוש.
מגע עם ממיסים אורגניים ישפיע באופן משמעותי על המדגם. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש רכז ואקום צנטריפוגלי לרכז את פתרון ELP ל 1.1 מילימולר. מערבבים 200 מיקרוליטרים של פתרון מרוכז זה עם 1, 250 מיקרוליטרים של תערובת כלורופורם ומתנול אחת.
מערבולת הפתרון לערבב ביסודיות. לאחר מכן, מוסיפים 1.5 גרם של חרוזי זכוכית כדוריים לבקבוקון תחתון עגול 10 מיליליטר. מוסיפים את תוסף ה-ELP והמתנול הכלורופורם לבקבוק התחתון העגול, ומנערים בעדינות לערבב.
חבר את הבקבוק לאידוי סיבובי. כווננו את המהירות ל-150 סל"ד והוסתו את הלחץ ל-20,000 פסקלים למשך כארבע דקות, עד שהנוזל מתאדה בטמפרטורת החדר. חשוב להיות זהיר בעת שימוש באידוי סיבובי עקב פיגור רותח אפשרי.
לאחר מכן, לעטוף באופן רופף רדיד אלומיניום סביב פתיחת הבקבוק התחתון העגול כדי למנוע אובדן של חסידות זכוכית ולהניח את הבקבוק לתוך desiccator לפחות שעה אחת, כדי להבטיח כי כלורופורם הנותרים מתנול התאדו. לניסוי יחיד, יש לערבב 100 מיליגרם של גם 100 מיליגרם של גם 100 מיליגרם של גם גם 100 מיליגרם של גם תותבי הזכוכית המכסים בפפטיד עם 60 מיקרוליטרים של תותב נפיחות. דגירה מדגם זה ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
השתמש צנטריפוגה העליון שולחן צנטריפוגה את הדגימות במהירות לעים גם את גם גם את גם גם את גם גם את תריסי הזכוכית. לאחר מכן השתמש פיפטה כדי לאסוף את supernatant, אשר מכיל את הווסיקים. ראשית, מערבבים 100 מיקרוליטרים של הדנ"א הפלסמיד המטוהר מראש עם 100 מיקרוליטרים של רוטי-פנול, כלורופורם או אלכוהול איסואמיל בצינור מיקרו צנטריפוגה כדי לאפשר הפרדת פאזה טובה יותר.
בעדינות להפוך את הצינור עד שש פעמים צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של כלורופורם לשלב העליון, ולהפוך את הצינור עד שש פעמים. צנטריפוגה המדגם ב 16, 000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לאחר מכן, פיפטה supernatant לצינור נפרד ולהוסיף 10 microliters של שלושה אצטט נתרן טוחן עבור משקעים אתנול. מוסיפים מיליליטר אחד של אתנול קר ב 80 מעלות צלזיוס ולאחסן את המדגם ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם ב 16, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
תפענחו את העל-טבעי ותוסיפו מיליליטר אחד של אתנול קר של 70% ב-20 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את הנוזל על ידי צינורות, נזהר לא להפריע גלולת DNA.
לאחסן את המדגם בטמפרטורת החדר במשך כ 15 דקות כדי להתאדות את האתנול הנותר. לאחר מכן, להוסיף מים טהורים במיוחד לדגימה כדי להתאים את ריכוז המדגם כ 300 nanomolar, אשר נמדד על ידי ספיגה ב 260 ננומטר. כדי להכין את תגובת התמלול-תרגום, בצע את חילוץ התא הגולמי מוכן ואת חיץ התגובה על הקרח.
לתערובת תגובה של 60 מיקרוליטר, הוסיפו את הדנ"א של הפלזמה ל-37.5 מיקרוליטרים של מאגר התגובה, הוסיפו 28.7 מיקרוליטרים של תמצית תאים גולמיים ומלאו במים טהורים במיוחד לנפח סופי של 58.8 מיקרוליטרים. ממש לפני תחילת התגובה, להוסיף 1.2 microliters של פתרון פולימראז T7RNA, ואת פיפטה למעלה ולמטה לערבב. דגירה המדגם ותוכי נפיחות ב 29 מעלות צלזיוס למשך הניסוי, שהוא בדרך כלל ארבע עד שמונה שעות.
תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור של וקסיקים מראות כי פתרונות נפיחות שונים, כגון TX / TL או אפילו רק PBS יכול לשמש כדי ליצור וקסיקים. עבור שני הפתרונות, קביעת גודל היא צעד קדימה ישר. פיזור אור דינמי מראה כי וריונים שהוכנו ללא שיטת קדמת הזכוכית לגרום לקוטר של 134 ננומטר, עם פולידיספרסיות של 25% כאשר נעשה שימוש בחרוזי זכוכית, הקוטר גורם ל-168 ננומטר, עם פולידיספרסיה של 21% עוצמת הפלואורסצנטיות של שני חלבונים פלואורסצנטיים, המתבטאים בתוך ורי ELP, נמדדת לאחר מכן באמצעות קורא לוחיות פלואורסצנטיות.
חשוב לציין כי לאחר היווצרות ווסקל, התוכן של הויקלים ואת הפתרון החיצוני זהים, ולכן, אנטיביוטיקה Kanamycin מתווסף לפתרון החיצוני כדי לדכא ביטוי חלבון. כשליטה, Kanamycin מתווסף גם פתרון נפיחות, במקרה זה ביטוי חלבון בתוך הווסת. הדבר מצביע על כך שקנאמיצין אינו מתפזר דרך הממברנה, ומדכא כל הזמן את הביטוי הפנימי.
לאחר מכן מתבצעת ההתמדה FRET כדי להדגים שילוב ELP לתוך הממברנה. עם הביטוי של ELPs הממברנה, פפטידים נוספים לשלב לתוך הממברנה, אשר מגדיל את המרחק הממוצע בין זוגות FRET, ומביים לעלייה של אות התורם. הטכניקה המוצגת יכולה לשמש לייצור מיכלי תגובה פשוטים או ליצירת תאים מלאכותיים עם ממברנות מבוססות פפטיד.
ניתן לבחור את התוכן בפנים לפי הצורך. באמצעות ורידים פפטיד אלה, עכשיו אנחנו יכולים להסתכל קדימה על תגובות סינתזה מורכבות יותר בתוכם.
