פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר כימות של שני חלבונים באותו אזור במוח. זה מאפשר לניסוי להסתכל על פעילות במסלולי איתות מולקולריים באזורי המוח על ידי בדיקת מחבת ופוספופרוטאינים. זה יכול לשמש גם כדי לסמן חלבונים כי הם סמנים של תופעות קוגניטיביות שונות.
אנו משתמשים בטכניקה פשוטה יחסית, כגון אימונוהיסטוכימיה, כדי לענות על שאלות הדורשות בדרך כלל טכניקות מעורבות יותר. כולל בחינת הפעילות של מסלולי איתות מולקולריים, בחינת יחס אמפא/NMDA. באמצעות קריוסטט המתוחזק בין מינוס 9 מעלות צלזיוס למינוס 12 מעלות צלזיוס, פרוסת מוח חולדה מבודד וקפוא בעבר באזורים מעניינים ב 30-50 מיקרומטר.
יש להרכיב פרוסות ישירות על מגלשות זכוכית ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לאימונוציטוכימיה. מוציאים את מגלשות הזכוכית מהמקפיא ומאפשרים להן לצייד לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. עובדים מתחת למכסה המנוע של האדים, מניחים את המגלשות בפרפורמלדהיד של 4% ב-PBS טוחן למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר לצורך קיבוע רקמות.
לאחר מכן לשטוף את השקופיות ב 0.1 TBS טוחן שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. כדי לחלחל קרום התא, להדק את השקופיות בחומר ניקוי קל במשך 30-60 דקות. ולשטוף שוב ב TBS שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
לדלל את הנוגדן העיקרי עבור חלבון עניין PBS בריכוז הנכון כמתואר בכתב היד. פתרון הנוגדן העיקרי של פיגט ישירות לרקמת המוח. מניחים תלושי כיסוי על המגלשות ומדגרים את רקמת המוח בדילול נוגדנים ראשוני למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, להסיר את החלקות המכסה ולשטוף את השקופיות ב- TBS כי יש כמות קטנה של חומר ניקוי הוסיף אליו, ארבע פעמים במשך 15 דקות כל אחד. מדללים נוגדן משני בדילול המכיל TBS, חומר ניקוי ו-1.5% מהנסיוב המארח. מוסיפים נוגדן משני לשקופיות, מכסים בהחלקות כיסוי ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
לאחר הדגירה, לשטוף את השקופיות ב- TBS-T ארבע פעמים במשך 20 דקות כל ולאחר מכן ב- TBS ארבע פעמים במשך 20 דקות כל אחד. יבש את המגלשות בטמפרטורת החדר בחושך, לילה. מקם שקופיות על ממשק סריקה כמעט אינפרא-אדום כאשר הרקמה פונה כלפי מטה.
תמונה של שקופיות מרובות בכל פעם באמצעות כלי הבחירה. תדמיין את השקופיות בהגדרה באיכות הגבוהה ביותר ברזולוציה של 21 מיקרומטר. בקיזוז של אפס ננומטרים, יבא תמונות לתוכנת ניתוח תמונה כדי להציג ולסמן לניתוח חלבונים חצי-קונטיטיבי.
לאחר פתיחת תוכנת ניתוח התמונה, בחר את אזור העבודה שאליו נסרקה התמונה. לאחר מכן פתחו את התמונה הסרוקה בתוכנת ניתוח התמונות כדי להציג את הסריקה ולהתאים אורכי גל, ניגודיות, בהירות והגדלה המוצגים מבלי לשנות את התמונה הגולמית או את הפליטה הכוללת לכימות. לאחר זיהוי אזורי המפתח לכמות, בחר בכרטיסיה ניתוח לאורך החלק העליון של הדף ולאחר מכן בחר מלבן ציור כדי לצייר מלבן מעל האזור שיכומת.
כדי להציג את גודל המלבן, בחר צורות לאורך החלק הימני התחתון של המסך. לאחר מכן בחר עמודות לאורך הימנית התחתונה. לאחר מכן הוסף עמודות גובה ורוחב כדי לזהות את גודל הצורה.
לבסוף, תן שם לצורה וחזור על הפעולה. לאחר דגימת כל האזורים, המשך בשילוב וניתוח של הנתונים הזמינים בכרטיסיה עמודות. כדי לוודא שהפרוטוקול הזה עובד, חלקי המוח היו דגירה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, נוגדן משני בלבד, או לא נוגדן ראשוני ולא משני.
ביטוי הגן המוקדם המיידי c-jun זוהה בהיפוקמפוס הגבי ובאמיגדלה רק כאשר שני נוגדנים ראשוניים ומשניים הוחלו על רקמת המוח. יחידת משנה GluR1 של קולטן אמפא ותת-היחידה NR2A של קולטן NMDA הושפעו בזיהוי חלבון הצואה בגרעיני האמיגדלה. זה איפשר לבחון את היחס של קולטני AMPA NMDA בתת גרעינים של האמיגדלה שהיא חתימה נוירוביולוגית של למידה וזיכרון.
אמצעים מרושעים ומנורמלים של ביטוי חלבון התקבלו מסריקות ברזולוציה גבוהה בהיפוקמפוס הגחון. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, מלבן ממוקם באזור העניין ועוצמת האור הממוצעת מהצורה שימשה כמדד לביטוי פלואורופור, שהוא מדד לביטוי חלבון. כדי להשיג את העקומה המנורמלת, צורה הונחה על פני אזור המבטא אות גבוה ואות נמוך באזור מתחת לעקומה שימש כמדד לביטוי חלבון.
המאבק הגדול ביותר בהליך זה הוא מציאת נוגדן ולוודא שהוא עובד. היישום הוא פשוט. העצה שלי תהיה קודם לנסות הליך אימונוהיסטוכימי רגיל, ואז לנסות את הטכניקה הזו.
תמיד מבצע בדיקת אימות תחילה. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא לבדוק את דילול הנוגדנים שלך ולוודא שהוא מיושם כראוי. ללא שלבים אלה, ההליך ייכשל.
