פרוטוקולים אלה שפיתחנו חשובים ללמוד את מנגנוני הפרשת ציאנובקטריה ואת המוצרים המשוחררים שלהם, כלומר פולימרים וחלבונים פחמימות חוץ תאיים. הידע שנוצר יאפשר לנו להתאים אישית מוצרים אלה עבור מספר יישומים, כלומר יישומים ביוטכנולוגיים וביו-רפואיים. הפרוטוקולים האלה מאוד פשוטים.
הם יכולים להיות מותאמים על פי האורגניזם המייצר, צרכי המשתמש, ואת היישום הסופי של המוצר. היתרון העיקרי של פרוטוקולים אלה הוא שהם יכולים בקלות להיות מותאמים למערכות חיים אחרות, במיוחד חיידקים אחרים. הפרוטוקולים האלה קלים.
עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להציג כמה שינויים בהתאם לזן חיידקי או מידת הטוהר הנדרש. כדי להתחיל, לטפח את הזן ציאנובקטריאלי בתנאים סטנדרטיים. למדוד צמיחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
לאחר מכן, להעביר את התרבות לתוך קרום דיאליזה, דיאליזה נגד מינימום של 10 כרכים של מים deionized במשך 24 שעות עם ערבוב מתמשך. צנטריפוגה התרבות ב 15, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעבירים את העל-טבעי לבקבוקון חדש, ומשליכים את גלולת הבקבוקון.
צנטריפוגה שוב ב 20, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר מזהמים, כגון פסולת קיר התא או lipopolysaccharides. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את העל-טבעי לסק זכוכית, ומשליכים את גלולה. כדי לזרז את הפולימר, מוסיפים שני כרכים של 96% אתנול לעל-טבעי, ומטמיעים את ההשעיה בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
עבור כמויות קטנות או לא נראות לעין של פולימר מזרז, צנטריפוגה ההשעיה ב 13, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. השליכו בעדינות את העל-טבעי, והתינו מחדש את גלולת הכדור באחד עד שני מיליליטר של מים אוטו-סלאביים. מעבירים את ההשעיה המים לבקבוקון.
עבור גלוי, כמויות גדולות של פולימר זירז, לאסוף את הפולימר זירז עם מטלות מתכת סטרילית לבקבוקון. לסחוט את הפולימר, ולהשליך את האתנול העודף. כדי לבצע את תהליך lyophilization הידוע גם בשם הקפאה ייבוש, לשמור את הבקבוקונים עם פולימר זירז במינוס 80 מעלות צלזיוס לילה.
ליופיליזציה פולימר לפחות 48 שעות. לאחר מכן, לאחסן את הפולימר מיובש ב desiccator בטמפרטורת החדר עד לשימוש נוסף. כדי לרכז את המדיום, ראשית לטפח ציאנובקטריה בתנאים סטנדרטיים.
לפקח על צמיחת ציאנובקטריום באמצעות הליכים סטנדרטיים. לאחר מכן, צנטריפוגה התרבויות ב 4, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעי לבקבוקון, ומשליכים את גלולת התא.
לאחר מכן, סנן את המדיום המודק באמצעות מסנן גודל נקבוביות של 0.2 מיקרון. כדי לרכז את המדיום כ 500 פעמים, להשתמש concentrators צנטריפוגלי עם ניתוק משקל מולקולרי נומינלי של שלושה קילודלטונים צנטריפוגה 4, 000 פעמים גרם ו 15 מעלות צלזיוס לכל היותר שעה אחת סיבוב צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, לשטוף את הקירות של מאגר מדגם התקן המסנן עם מדגם מרוכז, ולהעביר את התוכן צינור microcentrifuge.
בצע שלב כביסה נוסף של מאגר הדגימה של התקן הסינון עם מדיום התרבות autoclaved כדי להבטיח התאוששות אקסופרוטומה מקסימלית. לאחר מכן, לאחסן את דגימות exoproteome במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. אתנול יש להוסיף במרץ כדי לייעל את משקעים פולימר ותפוקה.
לאחר צנטריפוגה פולימר זירז, להשליך את supernatant צריך להיעשות בזהירות על מנת למנוע הפוגה של גלולה שעשוי להיות מחובר באופן רופף על הקיר של בקבוקון. אם סינון ידני מבוצע, זה צריך להיות עדין כדי למנוע שבירת קרום המסנן. כמה פולימרים זירז יכול להיות גלוי רק לאחר צנטריפוגה, בעיקר על הקירות של flasks, כגון במקרה של EPS מ Synechocystis.
במקרים אחרים, כגון פולימר Cyanothece, ניתן לראות את גושי פולימר צף ב זכוכית רק לאחר משקעים. זיהומים מסוימים ניתן לזהות בקלות מקרוסקופית לאחר ליופיליזציה פולימרית שכן הם ישנו פיגמנטציה פולימרית, בדרך כלל לבן או חום בהיר. פולימרים כתומים מזוהמים עם קרוטנואידים או מבנים המכילים פיגמנטים אלה.
לדוגמה, פולימרים ירוקים מזוהמים עם פסולת תאים וכלורופיל. Exoproteomes יכול להשתנות באופן משמעותי בהתאם לזן חיידקי. ראה, למשל, האקסופרוטאום של ציאנובקטריום חד תאי וזה מזן filamentous.
הכמות הגבוהה של פוליסכרידים בדגימות מרוכזות exoproteome יכול לעכב את ניתוח exoproteome. לדוגמה, זה יכול לעכב את הפרדת החלבון ולהסוות חלבונים פחות בשפע. המשתמש יכול לאפיין את הפולימר במונחים של הרכב, תכונות פיזיקליות /כימיות, בדיקת פעילות ביולוגית פולימרית, או רכיבי פולימר שונה.
לזיהוי חלבונים, ניתן לבצע הפרדת חלבונים בג'ל ובספקטרומטריית מסה. ועל הפרדת זרזים, יש לבצע אולטרה-מרכז של האקסופרוטום. בקבוצה שלנו, פרוטוקולים אלה כבר סללו את הדרך לפענח מנגנוני הפרשת ציאנובקטריאליים או יישומים של פולימרים פחמימות חוץ תאיים בתחומים שונים, כגון ביו-שיקום או כסוכני אנטיטומור או אספקת תרופות.
