זה כבר מבוסס היטב כי המבנים של חלבונים רבים התייצבו בקישורים disulfide קוולנטי. בעבודה האחרונה קשר זה סווג כשינוי שלאחר התרגום. לכן, חשוב להיות מסוגל לזהות קומפלקסים מולטימרים מיוצבים ציסטאין בתאים חיים באמצעות שיטה מהירה ופשוטה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי התוצאות ניתן להשיג ולפרש במהירות, בקלות עם עלות מינימלית. כדי להתחיל, לגדל תאי מערכת הפעלה U-2 בצלחת שישה ס"מ מרובע במינימום חיוני בינוני גלוקוז גבוה, בתוספת 10% FBS ו 1% פירובט נתרן ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני. הפוך מלאי טרי של 10 מילימולרים iodoacetamide רק לפני השימוש.
לאחר התאים להגיע 50 כדי 60%confluency, להוסיף 0.1 מילימולר ריכוז סופי iodoacetamide ישירות למדיה תרבות התא. מטלטלים בעדינות את המנה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. לאחר מכן, שאפו את המדיה מהתאים, ושטפו את התאים בחמישה מיליליטר של PBS קר שלוש פעמים.
שאפו את פתרון הכביסה הסופי של PBS, והוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר. מגרדים את התאים מתחתית המנה באמצעות מגרד תאים. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד לצייר את PBS ואת ההשעיה התא ולחלק את כל הנוזל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
לסובב את התאים ב 7, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. שאף PBS משאיר את גלולת התא מאחור. גלולת התא ניתן לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד עיבוד.
כדי לחלץ את החלבון, הכינו 100 מיקרוליטרים של מאגר תיזה פי 1 מדולל במים מזוקקים כפולים. יש להוסיף PMSF מיד לפני השימוש בריכוז סופי של מילימולר אחד. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מאגר התזה 1X ישירות לכדור התא והשעו מחדש.
להחגירה את התמצית על הקרח במשך חמש דקות. Sonicate במשך שמונה שניות באמצעות מצב הדופק הקבוע ב 40%שמירה על התמצית על הקרח. לסובב את התמצית בארבע מעלות צלזיוס ו 16, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות.
בצע ניתוח ברדפורד כדי לקבוע את ריכוז החלבון אם תרצה. כדי להכין את המדגם לקחת 10 microliters של תמצית חלבון מסיסים ולהוסיף 10 microliters של מאגר מדגם 1X Laemmli SDS. שמור את הדגימות על קרח.
מחממים את הדגימה ב 85 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני הפעלת הג'ל. כדי להתחיל בקישור הצולב של הפורמלדהיד, הגדל את תאי מערכת ההפעלה U-2 בבקבוק של 175 ס"מ רבועים ל- 70 עד 80%. במכסה המנוע של האדים מוסיפים את התיקון הפורמלידייד ישירות למדיום לריכוז סופי של 1% ודגירה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה במשך 15 דקות.
כדי לרוות את התגובה להוסיף 1.25 גליצין טוחן לריכוז הסופי של 0.125 טוחן דגירה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה על נדנדה במשך חמש דקות. לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS קר שלוש פעמים. שאפו את פתרון הכביסה הסופי של PBS והוסיפו 10 מיליליטר של PBS.
מגרדים את התאים מתחתית הבקבוק באמצעות מגרד תאים. באמצעות פיפט 10 מיליליטר לצייר את PBS ומתלה התא ולחלק את כל הנוזל לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מיליליטר. לסובב את התאים ב 500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.
שאף PBS משאיר את גלולת התא מאחור. הכן 10 מיליליטר של מאגר הומוגניזציה על ידי הוספת 0.25 סוכרוז טוחנת, EDTA מילימולרי אחד, 10 HEPES מילימולרית ו 0.5% BSA ב pH 7.4. מיד לפני השימוש, מוסיפים PMSF לריכוז סופי מילימולארי אחד ושלושה מיליליטר של חיץ המתלים הגרעינים.
הוסף חמישה מיליליטר של מאגר הומוגניזציה ישירות לכדור התא ולתלות מחדש לחלוטין. צנטריפוגה ההשעיה ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולתלות את גלולה בחמישה מיליליטר של חיץ הומוגניזציה.
ואז עם זכוכית צמודה טפלון homogenizer dounce הומוגניזציה התאים ב 10 משיכות לכל 500 סל"ד ו צנטריפוגה ההשעיה ב 1, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה להשליך את העל טבעי. תן את גלולה במיליליטר אחד של חיץ המתלים גרעינים דגירה על קרח במשך 10 דקות.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, להשליך את supernatant, resuspend את גלולה במיליליטר אחד של חיץ ההשעיה גרעיני צנטריפוגה שוב. גלולה הסופית תהיה הגרעינים המבודדים.
יש לחלץ את החלבונים כמתואר לפני הוספת 25 מיקרוליטרים של מאגר התיזה 1X ישירות לכדור התא. לאחר מכן הכינו שתי דגימות ל-SDS PAGE על ידי לקיחת 10 מיקרוליטרים לכל תמצית חלבון מסיסים והוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר דגימת 2X Laemmli SDS ומיקרוליטר אחד של BME. מחממים דגימה אחת ב-37 מעלות במשך חמש דקות ואת הדגימה השנייה ב-98 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להפוך את הקישור הנגדי של הפורמדהיד.
הכן ליטר אחד של חיץ ריצה טריס גליצין 1X על ידי ערבוב 25 מילימולרים טריס, 192 גליצין מילימולר ו 0.1% משקל לכל נפח SD. לאחר מכן הגדר את מנגנון הריצה של דף SDS. פתח את חבילת TGX SDS-PAGE של 16%precast לפי פרוטוקול היצרן והסר את המגירה. מוציאים את המסרק כי הוא רירית בארות ואת הקלטת מתחתית הקלטת וממקמים את הג'ל לתוך המנגנון פועל.
מלאו את התא במאגר הריצה 1X עד שה בארות שקועות בנוזל. באמצעות פיפטה פלסטיק לשטוף את בארות עם חיץ פועל. טען את הדגימות על הג'ל יחד עם 10 מיקרוליטרים של הסמן הסטנדרטי המוכתם מראש.
לבסוף, להפעיל את הג'ל ב 200 וולט עד חזית הצבע הוא כ סנטימטר אחד מתחתית הג'ל. ניתוח כתם מערבי של תמציות תאים כוללות בהיעדר סוכן להפחתת BME הדגים היווצרות מורכבת רב-כוכבית באוכלוסיות תאים אנושיות שונות. המתחם נעלם עם הוספת BME בכל ארבעת קווי התא שנבדקו, מה שמצביע על נוכחות של חיבור דיסולפידי.
האישור המונומרי של dUTPase בתאים אנושיים בזמן הקציר הוא שילוב של לפחות שלושה מהאיזופורמים של dUTPase:isoform המיטוכונדריאלי, isoform הגרעיני, וגרסה קטועה ציין ב M24. האזופורם המיטוכונדריאלי המשמש כבקרה לא יוצר קשר דיסולפידי והיגר למשקל המולקולרי החזוי של החלבון המונומרי. פורמלדהיד הצלבה של dUTPase גרעיני הפגינו היווצרות מורכבת רב-מימרית.
כאשר הקישור הנגדי התהפך על ידי דגירה המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, המתחם היה חסר יציבות ו ניתן לדמיין במצבו המונומרי. הוספת iodoacetamide הוא צעד חשוב בהליך זה כדי לחסום את שאריות ציסטאין חינם כדי להבטיח כי הקישורים disulfide אינם תוצאה של הליך החילוץ. חשוב לזכור לא להוסיף כל סוכן צמצום, כגון BME או DDT לדגימות SDS-PAGE שלך כמו אלה יפחיתו את כל הקישורים disulfide נוכח המדגם שלך.
