פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מודל עכבר לא אקראי לבדיקה וכמות של הפעלה מחדש של כרומוזום Mecp2 לא פעיל מקושר X במוחו של עכבר חי. מודל זה ניתן לשנות בקלות כדי ללמוד Xi הפעלה מחדש במודלים אחרים של מחלות הקשורות X כגון תסמונת DDX3X. אני פוסט דוק במעבדה של סנצ'יטה בהטנגר ואני אדגים את ההליך עם זמינג ז'נג.
התחל על ידי מיקום העכבר ההרדמה בפלטפורמה סטראוטקטית עם החותכים מכורים מוט הנשיכה של מרסן חוטם. הדקו את מהדק האף תוך שמירה על ראש העכבר במישור מאוזן. התאימו את גובה האוזן כדי להגיע לחלק הקוודאלי של תעלת האוזן כדי לשמור על הראש משותק.
לאחר מכן לחטא את הראש עם מגבונים לסירוגין של חיטוי אקטואלי 70%אתנול. כאשר העכבר מוכן, להשתמש אזמל סטרילי לעשות חתך אופקי 0.75 ס"מ בקרקפת האמצעית. השתמש 0.45 מילימטר בר לקדוח שני חורים סימטריים מעל ההמיספרות קליפת המוח הימנית והשמאלית שני מילימטרים מן התפר sagittal ואת התפר lambdoid באמצע המשוער של עצם קודקוד.
חבר בחוזקה מזרק 10 microliter לפלטפורמה סטראוטקטית לטעון 10 microliters של מעכב כימי מוכן טרי לתוך המזרק. לקדם את המחט לתוך החור בר הראשון תוך שמירה על המחט בניצב לגולגולת. כאשר המחט חוצה את הגולגולת, אפס את הקואורדינטות על התצוגה הדיגיטלית הסטראוטקטית ולקדם את קצה המחט עד שהוא מגיע לעומק של 2.5 מילימטרים.
משיכת המחט 0.5 מילימטרים לעומק של שני מילימטרים לאט להזריק את כל נפח 10 microliter של הפתרון על פני תקופה של דקה אחת. לאחר שכל המעכב נמסר, להשאיר את המחט במוח עוד דקה לפני משיכת המחט. חזור על ההזרקה לתוך חור בר השני באמצעות הרכב רק כפקד ולסגור את העור על החתך.
לאחר מכן להעביר את העכבר מן המנגנון הסטראוטקטי על כרית חימום 37 מעלות צלזיוס עם ניטור עד התאוששות מלאה. בסוף משטר המינון, לאבטח את העכבר על כרית חיטוי. השתמש מספריים ומדפים לעשות חתך צידי דרך ההסתייגות ואת דופן הבטן ממש מתחת לבית החזה.
בזהירות להפריד את הכבד מן הסרעפת לחתוך דרך הסרעפת לאורך כל הצלעות כדי לחשוף את החלל pleural. השתמש במספריים כדי להפוך חתך לקצה האחורי של החדר השמאלי מיד להזריק את תא הלב הימני עם כ 15 מיליליטר של PBS על פני תקופה של שתי דקות. תחליף מוצלח יגרום לשינוי בצבע הכבד מ אדום לוורוד חיוור.
כאשר כל PBS נמסר, לבלבל את הלב עם כ 10 מיליליטר של 4% paraformaldehyde ב PBS במשך שתי דקות. לאחר קצירת הראש, השתמש במספריים כדי לבצע חתך קו האמצע בקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת. מניחים קצה אחד של המספריים לתוך מגנום foramen כדי להקל על יצירת חתך בצלבי בגולגולת לכיוון העין.
בצע חתך דומה בצד השני של הגולגולת שמירה על קצה המספריים שטחי ככל האפשר לחתוך את האזור של הגולגולת בין העיניים ומעל האף של העכבר. השתמש במקלפים כדי לקלף בעדינות את עצמות הגולגולת מחצי הכדור במוח ולהשתמש מרית כדי לרומם את המוח. בזהירות לנתח את סיבי עצב הגולגולת לתקן את המוח לגולגולת וממקמים את המוח לתוך צלחת פלסטיק.
ואז בלו את המוח הקטן ונורות הריח. כדי להשיג חלקים של רקמת המוח, תחילה לתקן את המוח בצינור 15 מיליליטר מלא 4% paraformaldehyde ב PBS בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לשטוף את רקמת המוח לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס PBS טרי לכל לשטוף.
לאחר הכביסה האחרונה, להסיר את החלק הקדמי של כל חצי הכדור עם מספריים ומדפים ולמקום את הדגימות לתוך ההקפאה שכותרתו cryo-תבניות בצד הקדמי למטה. טביעה כל רקמה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בינונית לפני הצמד הקפאת הדגימות חנקן נוזלי בצלחת פטרי פלסטיק 10 מילימטר עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי לקבוע הפעלה מחדש של Xi, לטבול חמישה עד שישה מקטעי רקמת המוח מיקרומטר בתתברית אחזור אנטיגן במשך חמש דקות על בלוק חום 100 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות עם ארבע חמש דקות שטיפה בטמפרטורת החדר עם PBS טרי לכל לשטוף לפני שקוע את השקופיות בתסימת חסימה. לאחר 20 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים במשך חמש דקות במאגר לשטוף טרי לכל לשטוף. הכתם את דגימות הרקמה בנוגדנים הראשוניים המתאימים בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
תמונה השקופיות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי התאמת הניגודיות והבהירות כדי לאפשר כימות של מספר התאים החיוביים GFP עבור שניהם סמים ורכב מטופלים ההמיספרות המוח העכבר. כדי להדגים את ההיתכנות של מודל עכבר איון כרומוזום X לא אקראי עבור מחקרי הפעלה מחדש כרומוזום X לא פעיל, הגנוטיפים של פיברובלסט עוברי עכבר מהופנט נקבה אושרו על ידי genotyping PCR ו cytometry זרימה. כפי שהוערך על ידי PCR, הביטוי של GFP מתויג מתילן CPG חלבון מחייב שני גן או MECP2 הופעל מחדש על ידי תרופה אבל לא טיפול ברכב.
לא אקראי X כרומוזום איון עכבר מודל פיברובלסטים עובריים גם הביע GFP גרעיני לאחר טיפול תרופתי אבל לא רכב המדגים את מעכבי גורם איון כרומוזום X להפעיל מחדש כרומוזום X לא מופעל מקושר MECP2 ב fibroblasts עוברי העכבר. טיפול תרופתי הפעלה מחדש של כרומוזום X מ-MECP2-GFP בכ-30% מהתאים בהמיספרות מוח חדורים בסמים, בעוד שלא זוהתה הפעלה מחדש בהמיספרות חדורים ברכב. חלבון הקשורים Microtubule שני נוירונים חיוביים הם גם GFP חיובי בהמיספרות שטופלו בסמים המעידים על ביטוי כרומוזום X מושבת MECP2-GFP.
משטר התרופה יהיה תלוי במטרה ואת היעילות של מעכבי מולקולה קטנה כדי לייעל את המינון והטיפול במבחנה לפני הבדיקה במבחנה. מודל העכבר הלא אקראי יכול להיות מנוצל כדי לבדוק תרופות שונות בנפרד או בשילוב. למעשה, אנו ואחרים זיהינו מספר גורמי איון כרומוזום X מסוממים.
