מעקב תלת-מימדי אחר מולקולה אחת יכול לקבוע את לוקליזציה תת-תאית והתנהגויות תנועה של חלבונים בודדים. התבוננות בתנועה של חלבון בתא חי מספקת תובנות חשובות על האינטראקציה שלו עם שותפים מחייבים בסביבתו הטבעית. השיטה המוצגת כאן מספקת מסגרת כללית לניתוח נתוני מעקב של מולקולה אחת כדי לפתור את המצבים המפזורים של מולקולות ביולוגיות.
ניתן להחיל אותו הן על מסלולים תלת-מימדיים והן על מסלולים תלת-מימדיים המוגבלים לאמצעי אחסון של תאים בצורה שרירותית. לאחר הפקדת חרוז פלואורסצנטי במשטח אגרוז שהוכן מראש כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה, מניחים אותו על פתק כיסוי מיקרוסקופ ומאבטחים את החלקת המכסה למחזיק דגימת המיקרוסקופ. לאחר מכן, מחזיק הדגימה מותקן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
לאחר מכן אתחל את ממשק המשתמש הגרפי של המיקרוסקופ;כאן, תוכנה כתובה בהתאמה אישית ב- MATLAB משמשת לבקרת מכשירים. אתחל את תוכנת המצלמה HCImage Live. בכרטיסיה לכידה תחת המקטע בקרת מצלמה, הגדר את זמן החשיפה ל- 0.03 שניות ולאחר מכן לחץ על שידור חי כדי להתחיל הזנה חיה של המצלמה.
לחץ על כפתור לייזר פתוח המתאים בממשק GUI כדי לבטל את חסימת הלייזר ולרגש את חרוזים פלואורסצנטיים על כרית אגרוז. הצג את פליטת הפלואורסצנטיות במצלמה באמצעות מצב שידור חי. התאם את מיקומי ה- X וה- Y של שלב המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על החצים XY-Position מתחת למקטע שלב מיקום מיקרו של ממשק המשתמש כדי למקם לפחות חרוז פלואורסצנטי אחד במרכז שדה המבט.
במידת הצורך, לשנות את גודל הצעד על ידי לחיצה על התיבה הנפתחת מתחת החצים. לאחר מכן התאימו את מיקום Z של שלב המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על החצים Z-Position מתחת למקטע שלב מיקום ננו. הגדר את הכיוון של פונקציית כפולת ההפצה של נקודת הסליל של חרוז הפלואורסצנט לאנכית.
כיוון אנכי זה מוגדר כנקודת ההתחלה בכיול Z. סרוק 30 שלבים מעל ומתחת למיקום Z ההתחלתי במרווחים של 50 ננומטר. הקלט 10 מסגרות בכל שלב תוך זמן חשיפה של 0.03 שניות.
כדי להתחיל את רכישת הנתונים האוטומטית, לחץ על עבור תחת כיול Z. צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבות Yersinia enterocolitica בהלם חום ב 5, 000 פעמים כוח הכבידה במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ואז להסיר את התרבות ולהשליך את העל טבעי. לשטוף את גלולה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מדיה M2G.
לאחר שטיפה הסופית, תן שימוש חוזר בחיידקים גלולה ב 250 microliters של מדיה M2G. לאחר מכן להוסיף חרוזי פלואורסצנט להשתמש כמו סמנים נאמנות. יש להוסיף את פתרון חרוז הפלואורסצנט כך שיהיו רק 1-2 חרוזים לכל שדה מבט כאשר הם נצפו במיקרוסקופ.
מערבבים בעדינות את ההשעיה על ידי מערבולת כדי להפריד את כל התאים המצטברים ואת הצלחת 1.5 microliters של ההשעיה על כרית 1.5 עד 2% agarose עשה עם M2G, ואז להפוך את הפנקס ולהניח אותו על פתק כיסוי מיקרוסקופ ניקה אוזון. מוסיפים טיפת שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ ומ מניחים את מחזיק הדגימה על שלב המיקרוסקופ ומאבטחים אותו במקומו. אתחל את ממשק המשתמש הגרפי כדי לשלוט במצלמת המיקרוסקופ, שלב הדגימה ולייזר העירור ולאחר מכן אתחל את תוכנת המצלמה.
בכרטיסיה לכידה תחת המקטע בקרת מצלמה, הגדר את זמן החשיפה ל- 0.025 שניות ולאחר מכן לחץ על שידור חי כדי להתחיל הזנה חיה של המצלמה. התאם את מיקומי ה- X וה- Y של שלב המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על החצים XY-Position מתחת למקטע שלב מיקום מיקרו כדי לסרוק סביב המדגם ולמצוא שדה תצוגה עם אוכלוסייה צפופה כראוי של תאים חיידקיים. כדי למקסם את תפוקת הנתונים, צפיפות התאים בפתק הכיסוי צריכה להיות גבוהה ככל האפשר מבלי שהתאים יחפפו או יגעו זה בזה.
שדה המבט צריך לכלול לפחות חרוז פלואורסצנטי אחד כסמן נאמנות, כך שניתן יהיה למדוד את שינוי הבמה בזמן שהנתונים נרכשים. לאחר מכן התאימו את מיקום ה-Z של שלב המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על החצים Z-Position מתחת למקטע שלב מיקום הננו כך שאונות פונקציית פיזור הנקודות של חרוזי הפלואורסצנט יהיו אנכיות. לאחר מכן עבור אל רצף ובחר הגדרות סריקה.
שנה את מספר ספירות המסגרות ל- 20, 000. לאחר מכן בחר תיקיית יעד שמירה על-ידי לחיצה על הלחצן המסווים בשלוש נקודות. לבסוף לחץ על התחל כדי לאסוף עד 20,000 מסגרות מצלמה תוך זמן חשיפה קצר של 0.025 שניות.
בסיום, חסום את תאורת הלייזר על-ידי לחיצה על לחצן Close Laser המתאים בממשק המשתמש הגרפי. לאחר מכן לאסוף 200 מסגרות של תמונות כהות באמצעות אותו זמן חשיפה. סמן את התיבה ליד Thorlabs LED ולאחר מכן לחץ על החלף מצב מראה למעלה.פעולה זו תדליק אתנורית ה- LED מעל הדגימה ותחליף את המיקרוסקופ ממסלול הפלואורסצנטיות לתוואי ניגוד הפאזה.
אתחל את התוכנה לרכישת נתונים במסלול ניגודיות הפאזה ולחץ על לחצן התחל/עצור תצוגה חיה כדי להציג הזנה חיה מהמצלמה. לאחר מכן לחץ על לכידה ולך כדי לשמור את התמונה כדי לאסוף תמונת ניגודיות פאזה של התאים בשדה התצוגה הנוכחי. התאם את חרוז הפלואורסצנט לשימוש כסמן נאמנות.
חפש והתאים את כל ההתאמות המקומיות ואת כל מסגרות המצלמה באמצעות ספי התבנית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תחת המקטע DHPSF SM של Easy-DHPSF, לחץ על הפעל כדי להתאים לאותות של מולקולה בודדת ולאחר מכן לחץ על אישור בחלונות המוקפצים הבאים כדי לשמור על הגדרות ברירת המחדל. התוכנה תמצא אותות פלואורסצנטיים של מולקולה אחת הדומים לתפקוד כפול-סליל-נקודת-התפשטות ולאחר מכן ינסו להתאים אותם באמצעות מודל גאוסיאני כפול.
כאשר הסקריפט פועל, המשתמש יראה תצוגה של נתוני התמונה הגולמית, כמו גם תמונה משוחזרת של אותות מולקולה אחת מצויד בהצלחה. באמצעות תוכנה שנכתבה בהתאמה אישית ב- MATLAB, התחל בבחירה ידנית של חמישה זוגות נקודות בקרה בחלון המוקפץ על-ידי הערכה ולחיצה בערך על עמודי התא של אותם חמישה תאים הן בנתונים של לוקליזציה של מולקולה אחת והן בקווי מתאר של תאים. מחק תאים המכילים פחות מ- 10 לוקליזציה והסר תאים המוצבים בחלקם מחוץ לשדה התצוגה ולאחר מכן מחק תאים לא רצויים נוספים בחלון המוקפץ על-ידי לחיצה בתוך קו המיתאר של התא שלהם.
לבסוף, הקצה לוקליזציה הנמצאת בגבול המיתאר של תא לתא זה. בטל לוקליזציה שלא ממוקמת בחלוקה לרמות של תא. גורם קריטי ליישום המוצלח של פרוטוקול זה הוא להבטיח כי אותות מולקולה אחת מופרדים היטב אחד מהשני.
אם יש יותר ממולקולת פלואורסצנטיות אחת בתא בו זמנית, ניתן להקצות לוקליזציה באופן שגוי למסלול של מולקולה אחרת. פרוטוקול זה פועל כדי למנוע את בעיית הקישור על-ידי מחיקת מסלולים שעבורם שתי לוקליזיות או יותר נמצאות בו-זמנית באותו תא. לכן, אם אותות מולקולה אחת צפופים מדי, כמות גדולה של נתונים אלה נמחקים באופן אוטומטי במהלך העיבוד.
בהתאם לרמות הביטוי של חלבוני ההיתוך המסווים בפלורסנט, ניתן ליצור כ-200 עד 3,000 לוקליזציה לכל תא. לוקליזיות אלה יכולות להניב בין 10 ל -150 מסלולים. מספר רב של מסלולים נחוצים כדי לייצר הפצות שנדגמו היטב.
מוצג כאן הוא היסטוגרמה של מקדמי דיפוזיה לכאורה עבור קרוב ל 80, 000 מסלולים מולקולה אחת של Yersinia enterocolitica סוג 3 הפרשת חלבון YscQ שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי eYFP. YscQ נקשר להזרקות משובצות קרום וכתוצאה מכך שבריר של מולקולות, כ -24% שאינן מתפזרות, כפי שמצוין על ידי ההתפלגות המוצגת בשחור. מולקולות YscQ הנותרות מפוזרות בחופשיות בציטוזול.
במהלך השיטה המתוארת כאן, נקבע כי מולקולות YscQ לא מאוגדות קיימות בלפחות שלושה מצבי פיזור שונים. מסקנה זו הושגה על ידי התאמת התפלגות מקדמי דיפוזיה לכאורה עם ספרייה של הפצות מדומה עם מקדמי דיפוזיה ידועים. כאשר מנסים לפתור מספר רב של מצבי דיפוזיה, יש לאסוף כמה אלפי מסלולים של מולקולה אחת כדי להבטיח שהתפלגות מקדם ההתפזרות לכאורה תידגום היטב.
מעקב אחר מולקולה אחת יכול להתבצע בתאי סוג בר או במוטנטים למחיקה גנטית כדי לקבוע אם מצבים מפזרים ספציפיים באים לידי ביטוי רק כאשר שותף מחייב מולקולרי קיים. על ידי פתרון מצבים מפוזרים של חלבונים ציטוסוליים ותסביכים חלבון באמצעות מעקב מולקולה אחת 3D, החוקרים יכולים לקבוע היכן, מתי, וכיצד קומפלקסים חלבון אוליגומרי נוצרים בתאים חיים. עבודה עם מקורות לייזר בה הספק גבוה ופתוגנים אנושיים חיים יכולה להיות מסוכנת ביותר.
יש לעקוב תמיד אחר פרוטוקולי בטיחות לייזר וביו-בטיחות מתאימים.
