פיתחנו מלכודות תפוקה גבוהה כדי למדוד מלכודות חוץ תאיות נויטרופילים, או NETs. NETs הם מבני דנ"א אימונוגניים שנחשפים על ידי נויטרופילים. NETs יכולים ללכוד ולהרוג מיקרואורגניזמים ולכן הם מנגנון אנטי זיהומיות חשוב, אבל הם גם ממלאים תפקיד פתוגניים במחלות אוטואימוניות.
עם טכניקה זו, NETs הם כימות על ידי מיקרוסקופיה קונפוסל immunofluorescence תלת מימדי וכתוצאה מכך שיטה רגישה מאוד ותפוקה גבוהה ללמוד היווצרות נטו השפלה. טכניקה זו מאפשרת לנו לכמת היווצרות נטו של חולים עם מחלות אוטואימוניות. אקס ויוו נטו היווצרות של חולים עם דלקת כלי דם הקשורים ANCA או זאבת אדמתמטוזיס מערכתית יכול להיות במעקב עם הראיה זו.
בנוסף, טיפולים פוטנציאליים מיקוד היווצרות נטו יכול להיבדק עם זה מבחן במבחנה. בידוד נויטרופילים יכול להיות מאבק עבור אנשים שמעולם לא ביצעו את הטכניקה הזו בעבר. כדי להתחיל בהליך זה, להשיג 20 מיליליטר של דם היקפי מתורם בריא בשני צינורות 10 מיליליטר מקודד EDTA.
להעביר 10 מיליליטר של דם בצינור סטרילי 50 מיליליטר ו PBS לנפח הכולל הסופי 32.5 מיליליטר. באמצעות פיפסה 10 מיליליטר בקר פיפטה, לקחת 14 מיליליטר של שיפוע צפיפות. מניחים את הפיפסה בתחתית צינור ה-50 מיליליטר.
לאחר מכן, לקחת את בקר פיפטה את פיפטה, המאפשר שיפוע הצפיפות לזרום החוצה על ידי כוח הכבידה עד המקסימום הוא הגיע על ידי אפקט נימי. מניחים אגודל על גבי פיפטה כדי למנוע את שיפוע הצפיפות הנותרת דולף החוצה, ולאחר מכן להסיר את פיפטה מהצינור. צנטריפוגה הצינור ב 912 פעמים g בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות ללא תאוצה או בלם.
בזהירות להסיר את הטבעת הלבנה המכילה את התאים mononuclear הדם ההיקפי הראשון, בעקבות פלזמה מדולל PBS. לבסוף, הסר את שכבת מעבר הצבע של הצפיפות ככל האפשר. לאחר מכן, יש לאחזר ממקרר בקבוק מים מזוקקים סטריליים קרים ובקבוק PBS מרוכז פי 10.
עובדים במהירות, מוסיפים 36 מיליליטר של המים ישירות על גבי גלולה ומערבבים בזהירות פעם אחת. לאחר 20 שניות שנספרו מההתחלה, להוסיף ארבעה מיליליטר של 10x PBS כדי להפוך פתרון איזוטוני. ושוב, מערבבים פעם בזהירות.
צנטריפוגה הצינור ב 739 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. להשליך את supernatant, הקפד להיות זהיר מאוד כמו גלולה אינה מוצקה, במהירות לחזור על התהליך של הוספת מים מזוקקים סטריליים קרים PBS מרוכז כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה ב 328 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
בזהירות להסיר את supernatant מחדש להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של PBS. לספור את הנויטרופילים ולשמור אותם על קרח. ראשית, לעשות השעיה נויטרופילים המכילים כ 10 עד 20 מיליון נויטרופילים בשני מיליליטר של PBS בצינור 15 מיליליטר.
בצינור 15 מיליליטר אחר, מערבבים שני מיליליטר PBS עם ארבעה מיקרוליטרים של מקשר תא פלואורסצנטי אדום שני מיקרומולרי. מוסיפים בעדינות את פתרון מקשר התאים הפלורסנטיים האדום לתליית הנויטרופילים ומערבבים בזהירות. עוטפים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן על התערובת מפני אור, ו דגירה בדיוק 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לתייג את נויטרופילים עם מקשר תא פלואורסצנטי אדום.
בטל את התיוג על-ידי הוספת מדיום RPMI 1640 המכיל FCS מושבת בחום של 10% בטמפרטורת החדר לנפח סופי של 15 מיליליטר ומערבבים פעם אחת בזהירות. אם אחרי זה גלולה נוצרה, בזהירות להשעות את התערובת. צנטריפוגה הצינור ב 328 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לפני הסרת supernatant, ודא כי גלולה נוצרה. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של אדום חינם RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לספור את נויטרופילים.
הפוך מתלה תא בצפיפות של 420, 000 תאים למיליליטר ב פנול אדום חינם RPMI 1640 בינוני המכיל 2%FCS. הוסיפו 37, 500 נויטרופילים ב-90 מיקרוליטרים לכל באר של צלחת שחורה עם 96 באר, עם תחתית שטוחה. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של הגירוי הנבחר בטריפלקט כדי להגיע לריכוז של 10% בכל באר.
תמיד לכלול שליטה שלילית ב- triplicate. דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי, החל 30 דקות עד שתיים, ארבע, או שש שעות. לאחר מכן, הכינו את נפח צבע הדנ"א הבלתי חדיר הדרוש להוספת 25 מיקרוליטרים של צבע DNA אטום של חמישה מיקרומולרים כדי להגיע לריכוז סופי של מיקרומולר אחד בכל באר.
15 דקות לפני תום זמן הדגירה, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של צבע DNA בלתי חדיר של חמישה מיקרומולרים לכל באר. ממשיכים את הדגירה במשך 15 הדקות האחרונות ב-37 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן, להסיר את supernatant בזהירות רבה ולאחסן במידת הצורך.
הוסף 100 מיקרוליטרים של 4% פרפורמלדהיד. שמור את הצלחת בחושך, ומיד להמשיך לקטע הבא. לאחר קביעת התצורה של ההגדרות, בחר סידרת Z.
בחר 10 כמספר השלבים. בחר שלושה מיקרומטרים כגודל הצעד. טען את הצלחת לתוך מיקרוסקופ קונפוסל שפעת האימונו.
לחץ על הכרטיסיה הפעלה. מלא את השם והתיאור של הלוח ובחר את מיקום האחסון. בחר את בארות שיש לרכוש.
בחר את זמן החשיפה עבור טקסס רד ו- FITC. לאחר מכן, לחץ על צלחת רכישה ולהתחיל את הרכישה, אשר ייקח כשעה לכל צלחת. לאחר מכן, בחר ניתוח מאקרו.
לאחר מכן בחרו w1 ובחרו בערך הסף. לאחר מכן, בחרו בערך הפיקסל הרצוי. ולבסוף, בחלון תמונה J שני, בחר w2 ובחר את ערך הסף עם ערך הפיקסל הרצוי.
בחר יעד עבור קובץ הגיליון האלקטרוני, הפעל את הניתוח ושמור את קובץ יומן הרישום לאחר מכן. מוצג כאן הוא רגיש מאוד נרחב ישים assay עבור כימות אוטומטי למחצה של היווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ תאיים להערכת אקס ויוו אינדוקציה של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים על גירויים שונים. היווצרות NET מכומתת באופן תלת מימדי על ידי כימות דנ"א חוץ-תאי מוכתם מעל 10 ערימות Z עם מרחק של שלושה מיקרומטרים החל במישור המוקד בכל באר.
על ידי מדידת השטח המצטבר, הרגישות של ההתרגם גוברת. השטח הכולל של נויטרופילים מוכתמים בתמונה מכומתים רק במישור המוקד בכל באר אשר בקורלציה משמעותית עם ספירת נויטרופילים הכוללת בכל באר עם מקדם מתאם פירסון של 0.99. התוצאה הייצוגית של כימות היווצרות NET בנויטרופילים באה לידי ביטוי כאזור דנ"א חוץ-תאי מוכתם במצטבר מעל 10 ערימות Z לכל נויטרופילים בתמונה.
לאחר מכן נלקחות תמונות של מחש כימות הרשת. תמונות מייצגות של נויטרופילים לא מבודדים ו- NETs בנויטרופילים מגורים AAV מוצגים כאן עם נויטרופילים בעלי תווית פלואורסצנטיים באדום והדנ"א החוץ-תאי המוכתם בירוק. יש לטפל בנויטרופילים בזהירות, ויש לבצע את תיוג ה- PKH בדיוק בהתאם לפרוטוקול.
ניתן להשתמש במבחן זה כדי ללמוד מורפולוגיה, קינטיקה, והרכב של NETs. טכניקה זו היא שיטה נוספת המספקת את האפשרות ללמוד NETs בבריאות ומחלות. טריפאן כחול, PKH, ו PFA צריך להיות מטופלים עם כפפות ולא צריך לנשום ישירות.
