ההתמדה הטוקסיקולוגית של C.elegans היא בעלת ערך. פרוטוקול זה מתאר כיצד לטפל C.elegans עם כימיקלים בצלחת 384 באר, ללכוד קטעי וידאו, ולכימת פנוטיפים הקשורים טוקסיקולוגיה. שיטה זו יכולה לעזור לזהות ולחזות רעילות חריפה פוטנציאלית של כימיקל.
טכניקה כמותית זו פותחה כדי לנתח באופן אוטומטי את 33 הפרמטרים של C.elegans לאחר 12 עד 24 שעות של טיפול כימי בצלחת 384 באר עם מדיום נוזלי. C.elegans הוא בעל ערך כמודל טוב של הערכת רעילות מהירה עבור כימיקלים חדשים. כמו עכברים, זה יכול להיות מיושם על הקרנה רעילות ובדיקה של כימיקלים חדשים, או המתחם כמו זיהום סוכן תוסף מזון, תרכובת התרופות, תרכובת אקסוגניים הסביבה, וכן הלאה.
קרא את הפרוטוקול בעיון ותמיד בצע את צעד אחר צעד, אז אתה תהיה אחד טוב. להדגמה חזותית קל יותר למשתמש לראות את הפעולה של כל שלב ואת תוצאת הפעולה. הדגמת ההליך תהיה ואנג'ינג ג'אנג וגאוצ'או האן.
הם סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לבצע בדיקת קטלניות תולעת ראשונית עבור כימיקל חדש, כדי לקבוע את המינון הגבוה ביותר, ואת המינון הנמוך ביותר, שהם הריכוז המינימלי של 100% קטלניות, ואת הריכוז המרבי של 100% לא קטלני. לניסוי זה, הכינו שבעה ריכוזים הדרגתיים של קדמיום כלורי.
כדי להכין פי שניים מהתמיסה המקווית המרוכזת הגבוהה ביותר, יש להמיס 92.8 מיליגרם של אבקת קדמיום כלוריד מוצקה בצינור צנטריפוגה מלא בשמונה מיליליטר של K medium. וורטקס לערבב. לאחר האבקה מומסת במלואה, להשתמש פיפטה כדי למלא עד 10 מיליליטר.
מכינים את רמות הריכוז האחרות על ידי דילול עם K בינוני. בספסל סופר נקי, השתמש בקצה סטרילי כדי לבחור מושבה אחת של E.coli OP50 מצלחת הפסים, והצב אותו בבקבוקון עם 100 מיליליטר של מרק LB כדי לחסן את המושבה. לגדל אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר החממה.
יוצקים NGM לתוך צלחת פטרי פלסטיק 90 מיליליטר. זרע כל צלחת עם 300 מיקרוליטרים של פתרון E.coli OP50. דגירה תולעי N2 על לוחות NGM עם OP50 ב 20 מעלות צלזיוס במשך כ 2 עד 3 ימים, עד שרוב התולעים הגיעו לשלב הבוגר.
עם מים סטריליים, לשטוף תולעים gravid לתוך צינור צנטריפוגה חרוט סטרילי 15 מיליליטר לקצור. תן לתולעים להתיישב לפחות 2 דקות. שאפו את המים והוסיפו חמישה מיליליטר של חיץ אקונומיקה.
Vortex הצינור במשך חמש דקות, ולאחר מכן לשים את הצינור בצנטריפוגה להסתובב בכוח צנטריפוגלי יחסית של 1300 במשך 30 שניות כדי גלולה הביצים. השתמש בפיפטה כדי לשאפת את העל-טבעי. מוסיפים חמישה מיליליטר של מים מעוכלים לתוך הצינור כדי לשטוף את הביצים, ומערבולת הצינור במשך חמש שניות.
צנטריפוגה הצינור במשך 30 שניות, בכוח צנטריפוגלי יחסית של 1300. מוציאים את העל-טבעי ומוסיפים חמישה מיליליטר של מים מעוכלים כדי לשטוף שוב. פיפטה הביצים על צלחת NGM חדשה עם OP50.
דגירה אותם ב 20 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, התולעים הבקעות מגיעות לשלב L1. לאחר כ-40 שעות, התולעים מגיעות לשלב L4.
עם K בינוני, לשטוף את תולעי הבמה L4 את צלחות פטרי לתוך צינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר. פיפטה 50 מיקרוליטרים של נוזל התולעת מהצינור למגלשת זכוכית. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בפיגט כדי להתאים את ריכוז התולעים לכ-40 בעלי חיים לכל 100 מיקרוליטרים של K מדיום.
מוסיפים 50 מיקרוליטרים של המדיום המוכן לכל באר של צלחת 384 באר. תולעי שלב L4 מסונכרנות אלה מוכנות לטיפול הבא על ידי כימיקלים. לפני הוספת הכימיקלים, מניחים את לוחית 384 הבאר, עם התולעים המסונכרנות על הבמה האוטומטית, והגדירו מצלמת וידאו עם הליך הרכישה מתוכנת.
בצלחת 384 באר, תולעים מטופלים עם שישה עד שבעה מינונים של כל כימיקל בודדים, עם שמונה בארות מקבילות המכילות 50 microliters של פתרון כימי פעמיים עבור כל מינון. הכן לפחות שלוש קבוצות של שמונה בארות מקבילות של K medium כפקד. הוסף 50 microliters של פתרון כימי פעמיים עבור כל באר.
הגדר את השעה כנקודת האפס-שעה. לאחר מכן, שים את הצלחת 384 היטב בשייקר החממה להגדיר ב 20 מעלות צלזיוס, ו 80 מהפכות לדקה. לאחר הזמן הרצוי, מוציאים את הצלחת מהחמה ומעבירים לשלב האוטומטי.
קח קטעי וידאו של כל באר של הצלחת, ב 12 שעות, וב 24 שעות כדי לבדוק את פנוטיפים של התולעים. כדי להתחיל לעבד את הווידאו הניסיוני, העבר את קבצי הווידאו למחשב. באמצעות ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על לחצן בחר, כדי לבחור את ספריית תמונות המקור.
הוסף את ספריית התוצאות האמצעית. התוצאות האמצעיות כוללות את התמונות המיכללות, השימושיות להתבוננות החזותית בתמונות המעובדות. הוסף את ספריית התוצאות הסופית בממשק.
הגדר את פרמטר גודל התולעת הממוצע כ- 2, 000, בתיבת הטקסט גודל תולעת בממשק. הגדר את סף היחס שהועבר ב- 0.93 בממשק. לחץ על לחצן נתח כדי להתחיל את עיבוד התמונה.
התוכנית שפותחה יכולה לזהות תולעים ולכרות פנוטיפים באופן אוטומטי. בניסוי זה, 33 תכונות שונות כומתו לטיפול קדמיום כלורי בשלוש נקודות זמן, אפס שעות, 12 שעות, ו 24 שעות. תמונות ניסיוניות מראות שהתולעים מתו מהר יותר ככל שהריכוז הכימי גדל.
בהתחלה לא היה הבדל משמעותי בין הבקרה לטיפולים כימיים. לאחר 12 שעות של טיפול, התולעים שטופלו בריכוז גבוה הפכו ישרות יותר ומעוקלת פחות מאשר בריכוזים נמוכים יותר או בקבוצות ביקורת. אורך הציר הראשי של אזור מכוסה גוף התולעת גדל ככל שהזמן גדל.
יש גם מגמה הדרגתית מריכוזים כימיים נמוכים עד גבוהים יותר הן בציר הראשי והן באורך הציר המשני. תנועתיות התולעים, המבוססת על האזור ועל היחס, הראתה דפוסים דומים. לא נצפה הבדל משמעותי בהתחלה.
ככל שהזמן עבר, התולעים בקבוצת הביקורת הראו ירידה יציבה במניע. לאחר 12 ו -24 שעות, התולעים שטופלו בקרמיום כלוריד הראו הבדלים משמעותיים בהנעה, בהשוואה לקבוצות ביקורת. בנוסף, התולעים תחת טיפולים בריכוז גבוה יותר הראו תנועתיות חלשה יותר, בהשוואה לתולעים תחת טיפולי ריכוז נמוכים יותר.
לסיכום, טכניקה זו סוללת דרך להערכת רעילות מהירה בתחומים מרובים. חוקרים שיכולים ליישם את השיטה לניתוח חירום של רעילות במזון המועבר רעילות, הערכת הבטיחות של תרכובות התרופות, כמו גם הקרנת רעילות חריפה, וזיהוי של כימיקלים חדשים, ואת תרכובות אקסוגני הסביבה. קדמיום כלוריד הוא חומר רעיל נמוך.
אנא לבשו כפפות ומסכה במהלך הטיפול, ופעלו בהתאם להוראות ההפעלה.
