ניתוח תאים בזמן אמת של xCELLigence מאפשר לך לפקח באופן כמותי על הרג תאים סרטניים על ידי תאים חיסוניים בתנאים ללא תווית ובמהלך מספר ימים. מערכת זו מספקת קורס זמן מלא של הרג תאים סרטניים היעד המאפשר הקרנה בו זמנית של מספר רב של מבנים, סוגי תאים משפיעים, או טיפולים משולבים על יחסי השפעה נמוכים ליעד. התחל על ידי זריעת 1.5 פעמים 10 לשבעה תאי HEK293FT במדיום תרבות DMEM בצלחת תרבות תאים 150 מיליליטר עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות.
למחרת בבוקר, לערבב 2.5 מיליליטר של פתרון דילול transfection בתוספת חמישה מיקרוגרם של דנ"א פלסמיד וקטור lentiviral ו 22.5 מיקרוגרם של תערובת אריזה lentiviral עם 82.5 microliters של reagent transfection ב 2.5 מיליליטר של פתרון דילול חילוף. לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, להעביר את התגובה טיפה חכם לתוך המנה של תאי HEK293FT ולהחזיר את התאים לאנקובטור עבור דגירה לילה שני. למחרת בבוקר, להחליף את supernatant עם 19 מיליליטר של מדיום תרבות DMEM טרי ולהחזיר את התאים לחממה לילה.
לאסוף את supernatant לתוך צינור חרוט יחיד 50 מיליליטר עבור ארבעה מעלות צלזיוס אחסון במשך הימים הבאים לפני מעים את lentivirus על ידי צנטריפוגה בבוקר השני על מנת להסיר את כל התאים או פסולת מהפתרון. העבר את כל אבל על מיליליטר אחד של lentivirus המכיל על טבעי לצינור צנטריפוגה ברור במיוחד עבור אולטרהצנטריפוגה. לאחר ultracentrifugation, בזהירות לשאוף את הנגיף שיורית המכיל על טבעי, בעדינות להוסיף 100 microliters של DMEM לכדור, ולמקם את הצינור על קרח במשך 15 דקות.
בסוף הדגירה, מערבבים את הפתרון בעדינות ומערבבים את פתרון lentivirus לצינורות סטריליים מצוננים מראש לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לקבוע את טיטר של lentivirus על ידי RT-PCR כמותי על פי הוראות היצרן. עבור ייצור והתרחבות תאי CAR-T, הפעל אחד עד פעמיים 10 לש ששת תאי הדם המונונוקלריים ההיקפיים במיליליטר אחד של מדיום תא CAR-T עם מספר שווה של חיידקים מצופים CD3/CD28 באר אחת של צלחת 24 בארות באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.
בשני הבקרים הבאים, מערבבים מיקרוליטר אחד של סוכן משפר תפירה עם התאים ואחריו תוספת של lentivirus בריבוי של זיהום של חמישה לאחד. לפקח על צמיחת תא T כל יומיים עד שלושה ימים הוספת טרי CAR-T תא בינוני לפי הצורך כדי לשמור על התאים ב 1-2 פעמים 10 לשישה תאים לריכוז מיליליטר. כדי לזהות ביטוי T cell CAR על ידי ציטומטריית זרימה, העבר שלוש פעמים 10 למכונית החמישית ותאי T שאינם מתומרים לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר.
לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה resuspend כדורי ב 200 microliters של מאגר FACS בתוספת 1% סרום אנושי. לפצל כל דגימת תא לתוך 100 aliquots microliter בודדים חמישה צינורות FACS פוליסטירן מיליליטר על קרח. לאחר חמש דקות, להוסיף microliter אחד של שברי FAB2 biotinylated של עז נגד עכבר FAB2 לצינור אחד של כל סוג תא ושני microliters של נוגדן נגד תג PE שכותרתו לצינור השני של כל סוג תא עם ערבוב יסודי.
לאחר 30 דקות על קרח, לשטוף את התאים עם שלושה מיליליטר של חיץ FACS טרי ולאחר צנטריפוגה decant את supernatants. תוסיפו את הכדורים לשארית העל-טבעית ותוסיפו שני מיקרוליטרים של APC נגד CD3 ושני מיקרוליטרים של 7-AAD לכל צינור. הוסיפו מיקרוליטר אחד של סטרפטבידין עם תווית PE עם ערבוב קצר לצינור המוכתם בנוגדן אנטי FAB2 ודגירה של כל הצינורות על הקרח במשך 30 דקות.
בסוף הדגירה, לנתח את התאים על ידי cytometry זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים gating את התאים T על ידי פיזור קדימה לעומת פיזור בצד ו- CD3 לעומת ביטוי 7-AAD. למבחן עוצמת ציטוליזה בזמן אמת, הוסיפו 50 עד 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבות תאי היעד לכל באר של לוח אלקטרוני ולמדוד את פסיעת הרקע במכשיר מנתח תאים. לזהות את התאים הסרטניים היעד מצלחת התרבות באמצעות טריפסין.
לשטוף את התאים ב 15 מיליליטר של תרבות טרייה בינוני צנטריפוגה. תן שימוש חוזר את גלולת התא הסרטני בחמישה מיליליטר של מדיום טרי לספירה ולהתאים את צפיפות התא לריכוז תא היעד המתאים. מוסיפים את התאים למספר בארות המתאים ומשאירים את הלוח האלקטרוני למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים להתיישב באופן שווה בתחתית בארות.
בסוף תקופת שיווי המשקל, מניחים את הלוחית במנתח התאים בזמן אמת ויוזם מדידה של ההיכל באופן אוטומטי כל 15 דקות במהלך הלילה. ההיתוך וההתפשטות של תאי היעד ניתן לעקוב בזמן אמת. למחרת בבוקר, לדלל את המכונית אפקט ולשלוט בתאי T לריכוז המתאים צינורות בודדים ולהסיר 50 עד 100 microliters מכל באר של הלוח האלקטרוני, כך הנפח הסופי בכל באר הוא 100 microliters.
לאחר מכן, זרעו את תאי ה-T של המחולל והבקרה בארות המתאימות ביחסי המטרה המתאימים ב-100 מיקרוליטרים של מדיום ל הבאר. לאחר מכן לצייד את הצלחת האלקטרונית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני החזרת הצלחת למערכת מנתח התא. כדי למדוד את היעילות של תא T מתווך הרג של תאים סרטניים היעד, לפקח על הרג מתווך CAR-T במשך 96 שעות.
כ-50% מתאים CAR-T מוכתמים חיוביים לנוגדן שבר משתנה אנטי-שרשרת יחיד המציין את הביטוי של CAR בכ-50% מתאים T. בניסוי מייצג זה נעשה שימוש ביחס של 10 ל-1 משפיע אחד ליעד עבור כל הקבוצות. תאי ראג'י בלבד ותא CD22-CAR T שטופלו בתאי ראג'י הציגו הרג משמעותי בהשוואה לתא T הבקרה בלבד ולקבוצות תאים של Mock CAR-T.
בניסוי זה, רק תאי CD47-CAR-T היו יעילים בהריגת תאי סרטן הלבלב. יתר על כן, אות ההימנעות מתאי CD47-CAR-T בלבד היה רק מעט מעל אות מדד התא שנמדד בארות בינוניות בלבד המציין כי אות ההימנעות הנובע מתאי השעיה כגון תאי CAR-T הוא מינימלי ואינו תורם לאות ההימנעות הכולל כאשר תאי CAR-T מתווספים לתאי סרטן היעד. יש לציין, תחום GITR שיתוף גירוי נצפתה להיות יעיל יותר בשיפור הרג תאי CAR-T נגד תאי יעד חיוביים קולטן גורם גדילה אפיתל בהשוואה לבניית רכב המקורי ללא תחום GITR.
המדיום מ בארות e-plate ניתן לאסוף כדי לנתח את פרופיל ציטוקין בנקודות זמן או במהלך או אחרי ההתמדה על פי הצרכים של הניסוי. בסך הכל, xCELLigence שיפרה את היעילות של הערכת העוצמה של immunotherapies מגוונים החל מעורבים תאי T דו ספציפיים וירוסים oncolytic כדי מעכבי נקודת בדיקה חיסונית בטיפולים משולבים.
