שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח, על פיתוח ביופילם, כגון כיצד לזהות תנאים סביבתיים מרכזיים, המשפיעים על צמיחת ביופילם ומאפיינים התנהגותיים במהלך הפיתוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהצלחות הרב-ערוציות והמיקרו-נוזליות מאפשרות רכישה מהירה של תוצאות מובהקות סטטיסטית. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך מבנה biofilm, זה יכול להיות מיושם גם על המחקר של טיפולים אנטיביוטיים, bioremediation.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי תשומת לב זהירה לפרטי הפרוטוקול ומיומנויות קפדניות, יש צורך. כדי למנוע שגיאה של החיבור של המכשיר לתוכנה, הפעל תחילה את תחנת העבודה של המחשב ולאחר מכן את מודול הפלואורסצנטיות. ודא שתריס הפלואורסצנטיות דליל והפעיל את בקרי החומרה.
לאחר מכן, הפעל את בקר מערכת ההדמיה ואת מצלמת CCD. ואז להפעיל את תחנת ההדמיה. כאשר כל הציוד מוכן, הפעל את יישום הבקרה והזן את מספר הלוחית, הממוקם על התווית בצד הצלחת.
עבור priming, תחילה להסיר את צלחת מיקרו נוזלי 48 היטב מן האריזה, מבלי לגעת משטח הזכוכית בתחתית הצלחת, ולנקות את החלקת הזכוכית בתחתית הצלחת, עם רקמת עדשה. כדי להפוך את הערוצים מיקרו נוזלים, פיפטה 200 microliters של 37 מעלות צלזיוס מדיום מינימלי לתוך התפוקה היטב, דואג להימנע בועות. ואז למקם את הצלחת על הבמה צלחת.
לנגב את הממשק עם אתנול, איטום אותו על שלב הצלחת לאחר האתנול התייבש. במצב ידני במודול הבקרה, הגדר את הנוזל כמרק לוריא-ברטאני ב-37 מעלות צלזיוס, ומקסימום 5 דיאם לס"מ מרובע. לחץ על בארות הפלט כדי להפעיל את הזרימה מהפלט ל הבאר הקלט, כדי להפוך את הערוצים לראש.
לאחר חמש דקות, להשהות את הזרימה כדי להתכונן לזריעה, בזהירות להסיר את הצלחת מהבמה. לאחר מכן, שאפו כל מדיום שיורית מהפלט היטב מבלי להסיר כל מדיום מהמעגל הפנימי שמוביל לערוצי המיקרו-נוזלים. כדי לזרוע את הערוצים הניסיוניים, להוסיף 300 microliters של מדיום מינימלי לתוך באר הקלט, ואחריו תוספת של 300 microliters של תרבות חיידקית, לתוך הפלט היטב.
מחזירים את הלוח לשלב ההדמיה ומוודאים לנגב את הממשק עם אתנול לפני הנחתו על הצלחת, ולהשתמש בהזנת המצלמה החיה כדי להתמקד בערוץ אחד. תוך ניטור חזותי של ההזנה החיה, לחדש את הזרימה ב 1 עד 2 דיאם לסנטימטר מרובע במשך כ 2 עד 4 שניות, כדי לאפשר לתאים להיכנס לערוץ הניסוי אך לא ערוצי הנרפנטין, ולהשאיר את הלוח על הבמה מבוקרת הטמפרטורה במשך שעה אחת, כדי לאפשר לתאים לצרף. בסוף תקופת ההחזקה, להסיר בזהירות את הצלחת מהשלב ול שאפו את החיידקים מן הפלט היטב מבלי להפריע לערוץ.
לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה חדש כדי להסיר את המדיום מ בארות הקלט. בתוכנה, פתח רכישה מרובת ממדים כדי לשלוט ברכישת תמונת המיקרוסקופ, ובחר לשגות זמן, עמדות שלב מרובות אורכי גל מרובים. בכרטיסיה 'שמירה', צור שם בסיס פשוט, וודא ששמות הבסיס של ההטבעות אם הקובץ קיים, נבדקים.
כלול את כל הפרטים החיוניים של הניסוי בתיאור. לחץ על בחר ספריה, כדי לבחור את התיקיה שבה כל הקבצים יישמרו תחת לשונית הזמן לשגות, להתאים את משך הזמן הניסיוני, ל 24 שעות, ולהגדיר את מרווח הזמן כדי להשיג תמונות כל חמש דקות לאורך הניסוי. השתמש בהזנה של המצלמה החיה ובמטרה 10x כדי להגדיר את עמדות הבמה, תוך התמקדות במרכז הערוץ, הממוקם מעל או מתחת למספרי הערוץ החרוטים על הלוח.
עבור למטרה 20x, ואתר את אזור הצפייה האופטימלי ואת מישור המוקד בתוך הערוץ. לאחר מכן, הוסף את מיקום הבמה לרשימה עם ההגדרות החדשות. תחת תפריט אורכי הגל, הגדר את מספר אורכי הגל ל- 3, והגדר את אורך הגל הראשון ל- FITC 100%camera, עם זמן חשיפה של עשר אלפיות השניה, אורך הגל השני לבהירפילד 50% מצלמה 50%גלוי, עם זמן חשיפה מינימלי של 3 אלפיות שנייה ואורך הגל השלישי לכל סגור, כך שלא נשאר אור בערוץ האחרון בין זמני הרכישה.
בתפריט עריכת הפעלה אוטומטית, פתח את הכרטיסיה הגדרת פרוטוקול והגדר פרוטוקול חדש עם משך זמן של 24 שעות כאשר הזרימה מוגדרת בכיוון קדימה בקצב ההיפוי הניסיוני המתאים. לחץ על הוספה ושמור בשם כדי לשמור את הפרוטוקול ולפתוח את הכרטיסיה הגדרת רצף. כדי להגדיר רצף חדש, בחר מרק לוריא-ברטאני ב- 37 מעלות, כנוזל ברירת המחדל עבור כל הערוצים.
תחת איטרציה שלב 1 עבור ערוצים 1 עד 12, בחר את הפרוטוקול עם קצב ההמהר הניסיוני הראשון ולהפוך את כל הערוצים לזמינים. עבור ערוצים 13 עד 24, בחר את הפרוטוקול עם קצב ההיסוף הניסיוני השני והפוך את כל הערוצים לזמינים. לאחר מכן בחרו 'החל' ו'שמור בשם', כדי לשמור את הרצף ולפתוח את התפריט 'הפעלה אוטומטית' כדי לבחור את הרצף שנשמר שישמש להפעלה האוטומטית.
כדי להקים את ניסוי הביופילם של הצמיחה בזמן, הוסיפו עד 1300 מיקרוליטרים של מדיום מינימלי סטרילי לתוך באר הקלט של הלוח המיקרו-נוזלי, והחזירו את הלוח לשלב ההדמיה. לאחר מכן, לנגב את הממשק עם אתנול, ולאטום את הצלחת. ודא שהפרוטוקולים והרצפים מוגדרים כראוי.
בחר התחל, כדי להפעיל את 'הפעלה אוטומטית' ולחץ מיד על 'רכוש' כדי להפעיל את אוסף התמונות של המיקרוסקופ. בסיום רכישת התמונה הראשונה, לחץ על השהה ובחר את מצב התמונה החיה באורך הגל של שדה בהיר. בחר עבור אל כדי להציג כל מיקום שלב ובחר מוגדר כיום, כדי להגדיר את ההגדרות החדשות.
לאחר מכן, לחץ על חדש פעולה, לפני שתתחיל את הרכישה המתוזמנת הבאה. בניסוי גידול ביופילם מתוזמן זה, כיסוי הביופילם, או שטח הפנים של סף האחוזים, היה שונה עבור כל שלוש הגדרות ההטעיה, מה שמצביע על כך שלגבה הייתה השפעה ישירה על כיסוי פני השטח של הביופילם. המדידה היחסית הכוללת של הצטברות הביופילם, עלתה כפונקציה של זמן, כאשר קצב הגדילה ירד מלחץ ההמהר הגבוה ביותר ללחץ ההמהר הנמוך ביותר.
בכל תנאי הייתה גם תקופה ברורה של צמיחה אקספוננציאלית שממנה ניתן היה לחשב קצב גידול כמותי. בסך הכל, מקדם החספוס ירד עם הזמן בכל תנאי ההטיה, מה שמצביע על כך שכל משטחי הביופילם נעשו חלקים יותר. עם זאת, בהשוואה לגימה הנמוכה ביותר, הגדרות הגזירה הגבוהות יותר גרמו למשטח חלק יותר לאורך זמן, מה שמצביע על כך שזרימת הגזירה מהירה יותר תורמת למשטח חלק יותר ושווה יותר.
יתר על כן, האנטרופיה הטקסטואלית, או האקראיות במורפולוגיה, גדלה עם הזמן עבור כל תנאי ההטיה. בעת ביצוע הליך זה חשוב לזכור לעקוב אחר הרצף שצוין ולקחת את הזמן כדי לבצע כל שלב במדויק. הכישורים הדרושים יכולים לקחת כמה ריצות כדי לשלוט.
בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כגון HBLC או GCMS, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על ריכוזי substraights, כגון גלוקוז, להיות נצרך. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופילמים לחקור סביבות זרימה כלליות בזמן אמת עם תנאי ניסוי מבוקרים ודגימה הידרותרפית. אל תשכח, כי עבודה עם זנים חיידקיים BSL2 יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן תקין ושימוש בפרוטוקולי פסולת מתאימים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
