שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החלבונים הפלואורסצנטיים כגון כיצד חלבונים פלואורסצנטיים יכולים להשפיע על שותפי ההיתוך שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הערכה מהירה וקלה להרחבה של ההשפעות של חלבונים פלואורסצנטיים ושותפי ההיתוך שלהם. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה על התנהגות חלבון פלואורסצנטי, זה יכול להיות מיושם גם על תגים מקודדים גנטית אחרים.
כמו כן ידגים הליך זה יהיה סוניה די גרגוריו, שהוא סטודנט לתואר שני באוניברסיטה המערבית. כל חלבון פלואורסצנטי שנבדק בשיטה זו משוכפל תחילה לווקטור ביטוי שמרים המקודד גרסה בלתי ניתנת לעיכול גלקטוז של אקסון HTT מתויג על ידי FLAG אחד מחסה או לא רעיל 25Q לחזור או מחלת הנטינגטון הקשורים רעיל 72Q לחזור. שיבוטים נבחרים ומאומתים על ידי רצף ולאחר מכן הופכים לשמרים.
כדי להכין תרבות תאים עבור assays שונים, פס שיבוטים שמרים נושאת תג 25Q או 72Q עם חלבון פלואורסצנטי של עניין על צלחת אגר המכילה מבחר שמרים בינוני עם גלוקוז כמקור הפחמן. במקביל, שמרי פס הנושאים שמרים 25Q או 72Q אופטימיזציה סופר-תיקיות מונומרית GFP לשמש שליטה חיובית. דגירה הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים.
בחר עד שלוש מושבות בודדות מכל צלחת לחסן חמישה מיליליטר של מדיום מלא סינתטי בתוספת 2% גלוקוז כמקור הפחמן. דגירה התרבויות ב 30 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחרת, להעביר 200 microliters של כל תרבות לילה צינור microcentrifuge וצנטריפוגה כדי גלולה את התאים.
לשטוף לפחות שלוש פעמים עם מים מזוקקים סטריליים. חשוב לשטוף היטב את התאים כדי לחסל את כל עקבות הגלוקוז שיכולים לתרום להדחיקת הגיוס של מקדם GAL1. הכן את התאים כפי שהודגם בעבר והשהה אותם מחדש במדיום מלא סינתטי המכיל 2%galactose כמקור הפחמן כדי לגרום לביטוי של היתוך polyQ.
כפקד, השהה מחדש את התאים במדיה המכילה גלוקוז. דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס בצינור מסובב לילה. בבוקר שלמחרת, למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר של כל תרבות באמצעות ספקטרופוטומטר.
השווה את צפיפות התא לצפיפות אופטית של 600 מתוך 2 ב-100 מיקרוליטרים של מדיום שלם סינטטי בצלחת סטרילית של 96 בארות. הכינו ארבעה דילולים של פי חמישה מכל דגימה על ידי צינורות 20 מיקרוליטרים של המדגם מה באר הקודמת ל-80 מיקרוליטרים של מדיה באר הבאה. השתמש בכלי הצמדת שמרים כדי לזהות את התאים על צלחות סלקטיביות דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
תדמיין את הלוחות עם התקן תיעוד תמונה. הכן את תרבות התאים לתראה זו ולאחר מכן למדוד את OD600 של כל תרבות באמצעות ספקטרופוטומטר. לדלל את התאים OD600 של 1 ב 300 microliters של מדיה בצלחת 96 באר.
הכינו כל דגימה ב-triplicate. הדגירה את הצלחת באינקובטור קורא צלחת עם יכולות רועדות. הגדר את מספר הדגימות, הטמפרטורה ב 30 מעלות צלזיוס, הספיגה ב 600 ננומטר, אורך הניסויים ל 24 שעות, ואת מרווחי המדידה ל 15 דקות.
בחר את מצב הרעידות הרציף. כאשר הניסוי נעשה, ליצור את עקומת הצמיחה לכמת את האזור מתחת לעקומה באמצעות תוכנת גרפים מדעית. הדבק את הנתונים בטבלת XY עם שלושה ערכים משוכפלים.
עקומת הגדילה תוצג מתחת לתיקיית הגרפים בצד שמאל. לכימות האזור מתחת לעקומה, בחרו לנתח בחלק השמאלי העליון ולחצו על אזור מתחת לעקומה בניתוחי XY. התחל הליך זה על ידי דילול התאים המוכנים פי 10 במדיום הצמיחה.
העבר 200 מיקרוליטרים של כל דגימה לתא הדמיה של שמונה בארות. תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב סטנדרטי. התאם את הגדרות הדימות לרכישת תמונה.
מאז אגרגטים 72Q הם הרבה יותר בהירים מאשר אות 25Q מפוזר, הוא נדרש לעתים קרובות להשתמש הגדרת רכישה שונה בין plasmids שונים על מנת למנוע רוויה של אות פלואורסצנטי. לעבד את התמונות באמצעות תוכנה מתאימה לעיבוד תמונה. בפרוטוקול זה, כתם נקודה משמש לבחינת רמות ביטוי החלבון.
הכינו את המאגר ליצירת ליאזט חלבונים על ידי הוספת ארבעה מיקרומולרים של פלואוריד פנילמתילסולפוניל וקוקטייל מעכב פרוטאז למאגר התיזה. גלולה חמישה מיליליטר של כל תרבות לילה על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את התאים ב 200 microliters של גם גם 800 מיקרוליטרים של חיץ תזה.
מערבולת למשך 30 שניות ל-12 סיבובים, הדובדבן שבקצפת בין הסיבובים. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant. השתמש בקנסטרום microfiltration כדי לזהות כמויות שוות של חלבון הכולל על קרום nitrocellulose.
הרטיבו מראש את הממברנה עם PBS והרכיבו את המנגנון. חבר אותו למקור ואקום וודא שהברגים מהודקים. לטעון את הדגימות, להפעיל את הוואקום, ולתת לדגום לסנן דרך הממברנה על ידי כוח הכבידה.
תנפחו את הממברנה ב-PBS 05%Tween 5% חלב ללא שומן למשך 30 דקות. דגירה הממברנה עם נוגדן אנטי דגל ראשוני בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS 05%Tween.
הדגירה את הממברנה עם נוגדן משני שכותרתו פלואורסצנטי PBS 05%Tween 5% חלב ללא שומן בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS 05% Tween. לאחר מכן, תמונה הממברנה באמצעות מערכת תיעוד כתם אמינו.
שמרים המבטאים או 25Q או 72Q HTT exon אחד התמזגו שמרים אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP או שמרים אופטימיזציה תג מונומרי BFP2 היה מתורבת גלוקוז או גלקטוז בינוני לילה או הבחין על צלחות אגר או דגירה עוד יותר במדיה נוזלית. בעוד שמרים 72Q אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP גורם פגם צמיחה משמעותי. BFP2 תג מונומרי מותאם שמרים 72Q מציג פנוטיפ צמיחה דומה לעמיתיו 25Q רעילים המציין כי אופי התג הפלואורסצנטי יכול לעכב את התנהגות התפשטות polyQ בתאים.
הערכה של צבירה של היתוך polyQ פלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי מראה כי 72Q שמרים אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP מציג צבירה משמעותית, בעוד שמרים 72Q אופטימיזציה תג מונומרי BFP2 מציג אות ציטופלסמי מפוזר דומה עמיתים 25Q רעילים. מאז רמות הביטוי של היתוך polyQ שונים יכול להשפיע על רעילות, כתמי נקודה בוצעו כדי להעריך את רמות החלבון. תוצאות מדילול פי חמישה של ליsates התא מוצגים.
אל תשכח כי טכניקה זו מאפשרת השוואה מהירה של חלבונים לא אופייניים פלואורסצנטי עם גרסאות GFP, אבל זה לא יכול להעריך ישירות אוליגומריזציה. בעקבות הליך זה, אמצעים אחרים, למשל, את הבדיקה כיב בתאי יונקים ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות כגון המצב המונומרי של חלבונים פלואורסצנטיים.
