אמצעי זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח. בתחום ההומניולוגיה. תשובה זו בתפקוד המקרופאגים בקצה הפיזיולוגי של התנאים הפתולוגיים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי פוליאתילנימין מצופה יכול ביעילות להלהים במבחנה מבלי להתפשר על התא. תחת מינונים אופטימליים. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת טיפול ואבחון של הפרעות דלקתיות כרוניות רבות וסרטן.
כאשר מקרופאגים ממלאים תפקיד חיוני בפתוגנזה. הדגמת ההליך תהיה נה ג'יה. סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
וקאיקסואן וואנג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה של ד"ר שיאוהואה. כדי להכין חומצה אלילית שונה סופר paramagnetic תחמוצת ברזל חלקיקים או SPION הראשון להוסיף 28 גרם של פרעה כלוריד hexahydrate. ו -20 גרם פרעה עצמית heptahydrate לסק המכיל 80 מיליליטר של מים deionized.
ולהשתמש בצינור זכוכית כדי להכניס חנקן לפתרון. תוך ערבוב עד שהעניין המוצק יתמוסס. מחממים את תערובת התגובה ל-72 מעלות צלזיוס תוך ערבוב של 800 סיבובים בדקה.
ומוסיפים 40 מיליליטר של 28% מי אמוניה לבקבוק. לאחר חמש דקות להוסיף תשעה מיליליטר של חומצה אלילית טיפה חכם. ולשמור על התערובת ב 72 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות עם ערבוב מתמשך.
בסוף הדגירה מקררים את הפתרון שנוצר לטמפרטורת החדר. ולזרז את התערובת באמצעות הפרדה מגנטית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר מכן לשטוף את SPION המכיל לזרז שלוש פעמים עם אלכוהול אתיל מוחלט.
ולזרז את המשקעים ב-100 מיליליטר של נ-הקסאן. כדי להכין חומצה אקרילית dimercapto שונה SPION של להוסיף 800 מיליגרם של חומצה ברית שונה SPION של. התפזר ב 200 מיליליטר של n-hexane ו 400 מיליגרם של חומצה אקרילית dimercapto מפוזרים 200 מיליליטר של אצטון לתוך בקבוק שלושה צוואר באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס.
הבא להוסיף 200 microliters של טריאתילאמין טיפה חכם לבקבוק עם ערבוב ב 1000 סיבובים לדקה refluxing. משקעים שחורים ניתן להשיג על ידי הפרדה מגנטית לאחר חמש שעות. לאחר מכן השתמש tetramethylammonium הידרוקסיד כדי להתאים את ה- pH של הפתרון לפיזור הומוגני של SPION הידרופילי במים deionized.
מנוון פוליאתילנימין מצופה SPION של להוסיף את החומצה האקרילית dimercapto שונה הפתרון הקולואידי של SPION טיפה חכם לתוך 10 פתרון פוליאתילנימין קילודלטון. בבקבוק צוואר 500 מיליליטר תחת ערבוב מכני ב 1000 סיבובים לדקה במשך שעתיים. בסוף הדגירה להוסיף את הפתרון וכתוצאה מכך צינור סינון אולטרה עם משקל מולקולרי מנותק של 100 קילודלטון ותוכן של 15 מיליליטר.
Centrafuse המדגם עד הפתרון הנותר מגיע נפח מיליליטר אחד. הוסף מים deionized לפתרון כדי להחזיר את עוצמת הקול ל 15 מיליליטר. ו centrafuse ולייבש מחדש את הפתרון עשר פעמים נוספות כפי שהוכח רק.
לאחר מכן לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 22 מיקרון לאחסון בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את חלקיקי siRNA תחילה להוסיף שלושה microliters של פתרונות siRNA מיקרומולר מוכן טרי לחמישה צינורות microcentroafused חינם של RNA שכותרתו. ותוסיף 0, 8, 1.6, 3.2 ו-6.4 מיקרוגרם של פוליאתילנימין SPION לצינורות המסוגנים כאפס, אחד, שניים, ארבעה ושמונה בהתאמה.
לאחר ערבוב עם צינורות עדינים, הדגירה את הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את מתחמי SIRNA SPION פוליאתילנימין להיווצר. ולהכין ג'ל אגרוז שלושה אחוזים עם אני טוהר אגרוז. בסוף הדגירה מוסיפים מיקרוליטר אחד של מאגר טעינת דנ"א 6X לכל חמישה מיקרוליטרים של דגימה לכל צינור ומערבבים בזהירות.
ואז לטעון את כל הדגימות על הג'ל. ולהפעיל אלקטרופורזה בחמישה וולט לסנטימטר. עד שהצבע הכחול ברומופרנול נודד שני שליש מהאורך על הג'ל.
יום אחד לפני transfection לשטוף microphage העכבר כמו RAW264.7 תא תרבות עם PBS. ולטפל בתאים עם מיליליטר אחד של 25% טריפסין במשך חמש עד עשר דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני חמישה אחוזים. כאשר רוב התאים התנתקו.
השבת את טריפסין עם חמישה מיליליטר של DMEN מלא. לאחר מכן pippete הפתרון מספר פעמים כדי לפזר את כל אשכולות התא. העבר את ההשעיה התא לצינור קונקל סטרילי 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה.
ואז להשעות מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של DMEN שלם טרי לספירה. לדלל את התאים ל 4.5 פעמים עשר לתאים הרביעיים למיליליטר של ריכוז DMEN מלא. ולהוסיף שני מיליליטר של בינוני לכל באר של צלחת שש באר עבור אינקובציה 24 שעות ביממה באינקובטור תרבות התא.
למחרת להכין את היחס המתאים של פוליאתילנימין SPION siRNA חלקיקים ב 1.5 מיליליטר זרם RNA מיקרוצנטריפוגה צינור עם ערבוב עדין כפי שהודגם רק. ולהוסיף את הנפח המתאים של פוליאתילנימין SPION siRNA קומפלקס חלקיקים לכל באר אשר הוחלף עם מיליליטר אחד של מדיום טרי. הכינו מתחמי פוליאתילנימין SPION si.
במקרה זה חודשים רבים יותר של פוליאתילנימין SPION ניתן להשתמש ובכך למזער את הרעילות הפוטנציאלית שלהם. ואז מערבל את הצלחת בזהירות כדי להשיג חלוקה אחידה של הננו-חלקיקים על פני תחתיות הבאר. להחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא עד עדכון הסלולר הבאים או ניתוח חוסר נפילה גנים.
פוליאתילנימין SPION של עם פוטנציאל זטה של 30.5 ו 37 מילי-וולט אינם מפגינים רעילות ציטו לכאורה בריכוזים של עד 30 מיקרוגרם של ברזל למיליליטר. וזה בערך פי שניים לשכור מאשר הריכוז משמש בדרך כלל עבור transfection התא. פוטנציאל הזטה של פוליאתילנימין SPION של 48 מילי-וולט עם זאת הם רעילים.
אפילו במינון הנמוך ביותר שנבדק. כפי שנותח על ידי ציטומטריית זרימה, יותר מ 90% של תאים ניתן לשנות עם פלואורסצנטי שכותרתו פוליאתילנימין SPION siRNA קומפלקסים ב 15 מיקרוגרם של ברזל למיליליטר. הערכה של ההשפעות של ריכוזי SIRNA פוליאתילניאמין SPION על הפנמה הסלולר על ידי ריסוק כתמים כחולים מגלה כתמים מינימליים לזיהוי ב 7.5 מיקרוגרם של ברזל למיליליטר.
אבל כתמים גלויים בבירור ב 15 מיקרוגרם של ברזל למיליליטר כי אינם גדלים בריכוזים גבוהים יותר של ברזל סביר בשל פוליאתילנימין SPION siRNA ספיגת רוויה. מקרופאגים הצפקים עם ה-siRNA הספציפי של פוליאתילנימין SPION מציגים ירידה משמעותית ברמות ה-mRNA של targe בהשוואה ל-siRNA לא ספציפי. מציע כי siRNA יכול לברוח שלפוחיות אנדוציטיות לתוך הציטופלסמה כדי להגיע למכונות הפרעה RNA.
עוד יותר לאחר הזרקה תוך ורידי של מנה אחת של פוליאתילנימין SPION siRNA קומפלקסים חלקיקים flocentimetrical ניתוח של CD11b חיובי CD3 תאים חיוביים מגלה ספיגה יעילה יותר של חלקיקים על ידי CD11b הבעת מקרופאגים מאשר על ידי CD3 תאים חיוביים בכל נקודת זמן בכל האיברים שנבדקו. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להכין את פוליאתילנימין SPION של עם פוטנציאל נתונים ממוצע לא גבוה מ 37 מיליבולטים ולהכין את מתחמי SIRNA פוליאתילנימין SPION על יחס ברזל נמוך siRNA. טכניקה זו משווה את הצורך של חוקרים לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של מיקוד מקרופאג ' במנועים מן החי של מחלות אנושיות כגון וסרטן.
