המטרה של מערכת ביומימטית זו פשוטה 3D מבוסס תאים היא להקל על ניתוח קיבולת הפלישה באוכלוסייה גדולה של spheroid הגידול עבור הקרנת סמים אנטי גרורתי. היתרון העיקרי של מערך המיקרו-תאים ההידרוגל שלנו הוא שהוא מאפשר ייצור של מספר רב של כדוריות אחידות המאכלסות את אותו מישור מוקד ל הבאר. תנוחת הכדור נשמרת בשל מבנה המערך המיקרו-תאי הידרוג'ל גם לאחר תוספת מטריצה חוץ-תאית, מה שמקל על ניטור רציף מדויק של הכדורידים ותהליך הפלישה.
כמו כן, ניתן לבצע את האפיון המורפולוגי ואת הכתמת הפלואורסצנט של כדוריות ותאים פולשים רבים במקום ולנתח אותם ברזולוציה של יסוד אחד בצורה יעילה בזמן. הדגמת מערך מיקרו-תא הידרוג'ל שישה בארות תהליך ייצור צלחת הדמיה יהיה מריה סובולב מהמעבדה שלנו. כדי להכין את לוחות מערך מיקרו-תא הידרוג'ל, תחילה מחממים שישה polydimethylsiloxane, או PDMS, בולים ל 70 מעלות צלזיוס, וממקמים צלחת שש באר, תחתית זכוכית על אמבטיה יבשה מחומם מראש ל 75 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות.
כאשר הצלחת חמה, יוצקים טיפה של 400 מיקרוליטר של התעוררות בהמסה נמוכה ומחוממת מראש על תחתית כל באר של צלחת שש בארות, ומ מניחים בעדינות בול אחד על כל טיפה. אפשר את ההתקנה להתקרר במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס עבור ג'לציה אגרוז מלאה. כאשר התעוררות התגבשה, בעדינות לקלף את PDMS מכל באר, משאיר את ג'לים אגרוז בדוגמת מיקרו תאים.
לאחר מתן אפשרות למנורת ה-UV להגיע לעוצמה הגבוהה ביותר שלה, מניחים את הצלחת המובלטת במערכת ריפוי האור למשך שלוש דקות, וממלאים את בארות המאקרו המעוקרות ב- PBS סטרילי. לאחר מכן, לכסות את הצלחת, ולעטוף אותו עם Parafilm לאחסון ארבע מעלות צלזיוס עד השימוש. כדי לטעון את התאים, להסיר את PBS מכל באר, בעדינות לטעון 50 microliters של התאים של עניין על גבי כל מערך הידרוג'ל.
לאחר מתן אפשרות לתאים להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך 15 דקות, בזהירות להוסיף שישה עד שמונה aliquots של 500 microliters של מדיום טרי לקצה התחתון פלסטיק מקרו היטב מחוץ לטבעת מערך הידרוג'ל. הדגירה את התאים לתקופת הזמן המתאימה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות להיווצרות של כדוריות. לאחר מכן, להעביר את הכדורים לתוך מכסה המנוע biosafety על קרח במשך 10 דקות.
כאשר הצלחת התקררה, הישען קצה פיפטה על קצה תחתית הפלסטיק של macro-well ליד מערך ההידרוגל, והסר את כל המדיום מסביב למערך. לאחר מכן, מוציאים את המדיום ממיכל המערך, נשענים על קצה פיפסת טעינת ג'ל בקצה מיכל המערך בזהירות רבה, ומדאגים לא להפריע למיקרו-תאים ולספרואידים. לאחר מכן, השתמשו בקצה פיפטה קפוא מראש עדין כדי להוסיף שני אליקוטים של 150 מיקרוליטרים של תערובת הקולגן המעניינים בקצה המערך אחד בכל פעם, ומשחררים את התערובת לאט כדי למנוע נקע כדורי.
לאחר הסיבוב השני של קולגן נוספה כל באר, להחזיר את הכדורידים לאנקובטור במשך שעה אחת עבור gelation מלא של מטריצה חוץ תאית. כאשר המטריצה התגבשה, מוסיפים 400 מיקרוליטרים של אגוארו 1% נמסים מראש על גבי הג'ל, ו דגירה את הצלחת, מכוסה בטמפרטורת החדר, במשך חמש עד שבע דקות, לפני הקירור במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס עבור ג'לציה התעוררה. לאחר מכן, נשען פיפטה על קצה התחתון פלסטיק מאקרו היטב, בעדינות להוסיף שני מיליליטר של מדיום שלם לכל באר.
כדי לבצע בדיקת פלישה, העמיסו את לוחית המערך המיקרו-תאית של הידרוג'ל על שלב מיקרוסקופ ממונע הפוך המצויד באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עם אטמוספרה לחה, ולהשתמש במטרה של פי 4 או 10 כדי לקבוע מראש את המיקומים לרכישת התמונה בכל באר, כך שכל אזור המערך יוערך. לאחר מכן, לרכוש תמונות שדה בהיר כל שעתיים עד ארבע שעות במשך סך של 24 עד 72 שעות כדי לעקוב אחר פלישת התא מהגוף כדורי לתוך מטריצה חוץ תאית שמסביב. בסוף רכישת התמונה, יצא את התמונות לשגות בזמן מהתוכנה לרכישת תמונה לשמירה בתבנית קובץ תמונה מתויג לתיקיה ייעודית.
לאחר מכן, פתחו את ממשק המשתמש הגרפי ולחצו על 'טען שדה בהיר'. התאימו את פרמטרי הפילוח של התמונה כדי להשיג פילוח מדויק של הכדורואידים ואזורי הפלישה שלהם, ולחצו על פילוח אזור העניין כדי ליצור גבול סביב כל ספרואיד. אם הפילוח האוטומטי שגוי, הקש Delete או Add ובצע את התיקונים המתאימים באופן ידני.
לחץ על מעקב כדי למספר את הכדורים בכל אחת מהתמונות לשגות בזמן. לאחר מכן, לחץ על מדידה כדי ליצור גיליון אלקטרוני עם כל הפרמטרים, ושמור את הגיליון האלקטרוני בתבנית המתאימה לעיבוד נתונים וניתוח סטטיסטי. כדי לבחון את השפעת החומצה היאלורונית על תהליך הפלישה הספונטני של HeLa spheroid, בניסוי זה, כדורי עופרואידים בוגרים של יומיים כוסו בתתווית תערובת קולגן וחומצה היאלורונית ובהשוואה לספרואידים בוגרים של יומיים המ מכוסים בתווית קולגן בלבד.
לאחר 50 שעות של דגירה, הכדורידים המוטמעים בקולגן וחומצה היאלורונית הדגימו פיזור תאים נמוך יותר למטריצה החוץ-תאית שמסביב בהשוואה לספרואידים המוטמעים בקולגן בלבד. ואכן, ניתוח של קינטיקה אזור הפלישה לאורך זמן עבור 99 כדוריות ברזולוציה כדורית אחת מצביע בבירור כי תוספת של חומצה היאלורונית קולגן מעכב פיזור תאים מתוך הספרואיד, וכתוצאה מכך אזורי פלישה קטנים יותר. טיפול בתרבות הכדורית HeLa עם פלבנואיד ביו-אקטיבי עם תכונות ציטו ומיגרסטטיות למשך 24 שעות גורם לפיזור תאים מעוכב סביב הכדורידים בהשוואה לספרואידים HeLa שאינם מטופלים.
ואכן, ניתוח אזורי הפלישה של 488 כדורי עופרה בסוף הניסוי חשף עיכוב משמעותי לאחר הטיפול עם מעט ככל 10 micromolar של התרופה. בשל ההחזקה הנמוכה האופיינית להידרוגל, טכנולוגיה מבוססת מיקרו-תאים זו מקלה על היווצרות ספרואיד גם במקרים של מעט מאוד תאים. זהו יתרון במיוחד בדגימות תאים ראשוניות בעלות ערך מוגבל סרטן דמוי או המטופל נגזר.
לוחית ההדמיה המיקרו-תאית הידרוג'ל מאפשרת ניתוח של המיקום המרחבי המדויק של הספרואידים במהלך ניסויים ארוכי טווח להערכת תהליך הפלישה ברמת יסוד יחיד ומספקת רמה גבוהה של חוסן ודיוק סטטיסטיים. יישומים עתידיים של מתודולוגיה זו כוללים זה לצד זה culturing רב תאים של גידול ותאים סטרומה באזורים שונים בתוך המאקרו היטב ואת אחזור של כדוריות בודדות לניתוח מולקולרי במורד הזרם.
