שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיתוח שלאחר הלידה על יונק חלב הדרך משפיע על הלחץ איתות במוח. טכניקה זו יכולה לשמש ללכידת אזורים מסוימים במוח במהלך תקופת הרעב הטבעית הראשונה ולהשוות אותם לאזורים המתאימים זמן קצר לאחר הזנת קולוסטרום הטבעית הראשונה. הבנת האופן שבו יונק משפיע על הפיזיולוגיה של התנהגות ורגש מאפשרת שימוש באנטגוניסט לקולטנים שונים במהלך ניתוח רקמת המוח לשעבר של vivo.
כדי להשיג את אגרופי הגרעינים, הסר את גורי החולדות בזנבם ביד כפפה. לאחר קצירת המוח, מניחים במהירות את האיבר כולו בתבנית מוח פולימתיל מתקרילט בטמפרטורת החדר ומיד משתמשים בסכין גילוח חדש כדי ליצור פרוסות עובי של 500 מיקרומטר של הרקמה. מניחים את פרוסות rostral כדי caudal בצלחת פטרי כפי שהם מתקבלים כדי לשמור על האוריינטציה הנכונה של החלקים.
כאשר המוח כולו נותק, מוסיפים במהירות נוזל מלאכותי בעמוד השדרה המוחי ללא גלוקוז לצלחת ומדגרים את הפרוסות במשך 60 דקות ב 28 עד 30 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמיד על שייקר מסלולית. השתמש אטלס המוח ציוני דרך אנטומיים על כל רקמה כדי לזהות את גרעיני המוח להיות אגרוף ולמקום את הפרוסה עם הגרעינים של עניין צלחת פטרי חדש תחת מיקרוסקופ מנתח. לאחר הדמיה, השתמש בכלי coring כדי אגרוף במהירות החוצה ארבעה עד שישה גרעינים שונים במהירות לטבול כל גרעין אגרוף ב 0.06 מ"ל של חיץ מיצוי חלבון קר קרח בצינור מיקרו צנטריפוגה שכותרתו כראוי המכיל מעכבי פרוטאוס ומעכבי פוספטאז במשך 60 דקות.
בסוף הדגירה, צנטריפוגה הגרעינים שחולצו מיני צנטריפוגה מקורר, ולהשתמש מיקרו פיפטה להעביר בזהירות 0.055 מ"ל של על טבעי מכל צינור לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה מקורר מראש מתאים 1.5 מ"ל על קרח. לפני אחסון שלילי של 20 מעלות צלזיוס, מעבירים 0.012 מ"ל של על-טבעי מכל צינור מלאי חלבון לצינור הקירור מראש המתאים של 0.5 מ"ל על הקרח להכנת הדגימה הראשונה. כדי להכין את הדגימות למדידת חלבון נימי, להוסיף 0.003 מ"ל של ריאגנט תערובת הורים מערכת תזה חלבון לכל אחת מהדגימות בצינורות המסומן 0.5 מ"ל.
לאחר מכן, להוסיף 0.004 מ"ל של reagent תערובת הורים לתומת סולם משקל מולקולרי biotinylated ב 0.016 מ"ל של מים deionized, ו denature את הסולם ואת דגימות תמצית חלבון בבלוק חום 95 מעלות צלזיוס, אחסון כל הצינורות בארבע מעלות צלזיוס לאחר חמש דקות. לניתוח חלבון אות, להוסיף 0.01 מ"ל של פתרון תחמוצת לומינול טרי מוכן בארות E-1 כדי E-25 של צלחת מערבית אוטומטית חדשה, 0.01 מ"ל של נוגדן נגד עכבר משני בארות D-2 כדי D-25, ולהוסיף 0.01 מ"ל של peroxidase חזרת streptavidin מן הערכה כדי גם D-1. הוסף 0.01 מ"ל של נוגדן ראשוני שהוכן טרי לתוך בארות C-2 כדי C-25, ו 0.01 מ"ל של דילואנט נוגדנים שני פתרון בארות C-1 ו B-1 כדי B-25.
השאר את השורה F בארות ריקות ולמלא את חמשת התאים של שלוש השורות מתחת לשורה F עם 0.45 מ"ל של מאגר לשטוף. לאחר מכן, סובבו בקצרה את דגימות הקירור למשך 30 שניות והוסיפו 0.03 מ"ל של כל דגימה לכל באר של שורה A, החל מ- A-2. לאחר מכן, להוסיף 0.005 מ"ל של סולם משקל מולקולרי biotinylated גם A-1 ולכסות את הצלחת עבור צנטריפוגה.
בעוד הלוחית היא צנטריפוגה, לפתוח קובץ לרוץ חדש בתוכנה הקשורה המערבית האוטומטית ליזום חקירה בגודל מולקולרי. בדף הבדיקות, הזן את שמות הדגימות בכל נימי וכן את שמות הנוגדנים הראשיים והמשניים. בסוף הצנטריפוגה, מניחים את הצלחת בכלי המערבי האוטומטי ומקלפים את המכסה מקופסת מחסנית נימי.
לאחר צנטריפוגה, לא לשכוח לבדוק בועות אוויר, כי בועות אוויר נימי יכול לחסום את הזרם האלקטרופורטי להיכשל בסיבוב כולו. הכנס את המחסנית למיקום המיועד בתוך המכשיר וסגור את הדלת. לחץ על התחל.
כאשר תתבקש עם סוג ההתבקשות, הזן את שם הניסוי בתיבת הטקסט המתאימה ולחץ על אישור. כאשר תתבקש על-ידי תאריך ההפעלה הפעיל ומספר המזהה בקובץ ההפעלה, רשום לתשומת לב את השעה שבה מסתיימת ההפעלה. בסוף הריצה, השלך את מחסנית נימי לתוך סילוק החדים ואת הצלחת לתוך סילוק חומרים biohazardous.
לאחר הפרדת האלקטרופורזה, בדוק את קבצי הריצה עבור פסגות תגובתיות חיסונית של אנטיגנים ב 40 עד 43 קילודלטונים אשר מייצגים פקטור חניכת תרגום אוקריוטי זרחן 2A. כאשר פסגות משקל מולקולריות בגודל זה חסרות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני מתחת לעקומה ובחר להוסיף משקל מולקולרי לשיא כדי להבטיח שהגדלים והכמויות השרירותיות מתחת לעקומה יירשמו. בתוך דגימות רקמה unprimeds, מחייב רמות חלבון גלובולין אמינו בגרעין של המסלול הבודד גבוהים באופן משמעותי בהשוואה לכל האזורים האחרים.
התעצמות רקמת המעיים עם קולוסטרום מקטינה את רמות החלבון גלובולין אמינו מחייב בגרעיני המסלול הבודד ואין לו השפעה על גרעיני פרה-אונטריים וגוקלי סופר-אופטיים. לעומת זאת, הפרימינג מגביר את רמות החלבון של האמינו גלובולין בתוך קליפת המוח, גרעיני הסטריה וגוקלי הקדם-אופטיים המדיאליים ביחס לרקמה הלא-פריפריאלית, מה שמוכיח כי רמות חלבון האמינו גלובולין בגרעיני המוח שנבדקו מגיבות באופן שונה לפרימינג המעיים ועדיין אין שום הכלאה מוכחת בין הגרעינים השונים שנבדקו. גורם חניכת תרגום Eukaryotic 2A ו phosphorylated אוקריוטית ליזום גורם 2A רמות גבוהות במצב unprimed ביחס גרעינים אחרים.
לאחר הפרימינג, רמות של גורם חניכה תרגום eukaryotic 2A ו זרחן פקטור חניכה eukaryotic 2A מופחתים יחסית גרעינים של המסלול הבודד לעומת רקמה unprimed. בכל הגרעינים האחרים שנבדקו, priming מגביר את רמות גורם חניכת תרגום eukaryotic 2A ו phosphorylated גורם חניכה eukaryotic 2A יחסית רקמה unprimed. עם זאת, רמות של קולטן קינאז חלבון זרחן נמוכים בדגימות unprimed יחסית דגימות ראשוניות בגרעיני המסלול הבודד, מאוד מציע כי קינאז אחר מעורב זרחון של גורם חניכה תרגום איקריוטי 2A.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההתפתחות לאחר הלידה לחקור את מסלולי האיתות המעורבים בצמיחת רקמות ובבידול והאם הם מושפעים או אינם תלויים בניקור. אל תשכח כי עבודה עם סוכני צמצום נדיף כמו, למשל, dithiothreitol, יכול להיות מסוכן, אמצעי זהירות כגון הכנה מכסה המנוע הכימי תמיד צריך להילקח בעת הכנת הליך זה.
