Name: toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

המחברים רוצה thankthe ג'נקינס מיקרוסקופ מתקן אוניברסיטת ויומינג לעזרתם, חברי המעבדה הבושמנית, קלי Roballo, נכון היידן, Wupu Osimanjiang, וסובאש Dhunghana, סיוע בטיפול בבעלי חיים. פרסום זה התאפשרה על ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט # 2P20GM103432.

חולדות ספראג Dawley למבוגרים שימשו בפרויקט זה, כל הפרוצדורות אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ויומינג ועל שימוש הוועדה.
1. הניתוח ותוך קיבוע עצב Vivo
הערה: מידע הספק עבור כל חומרים וציוד המשמשים פרוטוקול זה מפורטים בטבלה של חומרים.
הערה: In vivo עצב קיבוע משמש כדי לשמר את הרקמות ולהפחית השפלה מבניות העלולות לנבוע בין שעת המוות אוסף של העצבים. In vivo קיבוע הרקמה אימון רגיל עבור הכנה של רקמת מערכת העצבים היסטולוגיה, שם נמצא זלוף לעיתים קרובות הקדמה זו. המיקום והגודל של העצבים ההיקפיים המותר עבור קיבוע באתרו. לא מומלץ איסוף של קיבעון של רקמות לאחר המתת חסד בגלל האפשרות של רקמות השפלה.
<ol><li>להתכונן העכברוש הרדמה כללית על-ידי הצבתו בתא אינדוקציה עם 2-3% איזופלוריין, ולאחר מכן למקם את העכברוש anesthetized במצב שכיבה על מזרון לנתיחה ולתחזק לפחות 1-2% של איזופלוריין באמצעות הרדמה חרוט האף. כדי להבטיח עומק נאותה של הרדמה, בדיקת חיות לנסיגה פדלים ליד הרגליים האחוריות ואיתור העדר רפלקסים palpebral בעיניים על-ידי נגיעה של canthus המדיאלי של העין. הערה: הזרקת בקרום הבטן של קטמין הוא חלופה נפוץ לאיזופלוריין הנשאף.</li>
	<li>כדי לחשוף בעצב, לגלח את השיער של hind limb(s) ולנקות את האזורים מגולח עם 70% אתנול. עם סכין או מספריים, עושים חתך 2-3 ס מ של העור לאורך האיבר הינד מן הברך עד הירך, איפה מישוש של עצם הירך באמצעות את האזמל סטרילי כדי להבטיח את המיקום הנכון של החתך. עצם הירך ממוקם רק מקורב את פלח הנגיש ביותר של בעצב. אף-על-פי זה ניתוח ההישרדות, לשמור על טכניקות סטרילי.</li>
	<li>לאחר ביצוע החתך בעור, לאתר את המטוס בין השריר הדו-ראשי לשריר העכוז, באמצעות מספריים microdissection נפרדים fascia כבסיס ולחשוף 2-3 ס מ קו תחתון בעצב. כדי לחשוף קטע ברור בעצב, השתמש מפסק כדי להרחיב את הפער בין שני השרירים (איור 1 א'). עם בסדר. מלקחיים ומספריים איריס, הפרד בזהירות את העצב שבסביבה רקמת חיבור, לוקח לא כדי לדחוס או לחתוך את העצב.</li>
	<li>הוסף מקבע מספיק של דונלד טראמפ (4% פורמלדהיד, גלוטראלדהיד 1% ב- PBS 1 x (buffered פוספט תמיסת מלח) עם טאו 1.16 גר' NaH2PO4· H2O לכל 100 מ ל) לתוך חלל המכיל העצב חשוף לכסות את העצב ולתת לשבת במשך 10 דקות. אם נחוץ, גאזה המקום תחת האחוריות רגל כדי לשפר את הזווית כך מקבע יותר ניתן להוסיף לתוך החלל. הסרת מקבע את לאחר 10 דקות, חזור על שלב זה פעמיים נוספות.</li>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ ויבתר, העצב משני הצדדים באמצעות מספריים לנתיחה בסדר, מקפיד לא למתוח או לצבוט בעצב, גזורה מיד לשים את הסעיפים עצב צינורות 15 מ"ל המכיל מקבע של דונלד טראמפ ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע, שינוי מקבע כל 48 שעות.</li>
	<li>אין להשאיר בעלי חיים ללא התערבות במהלך כל חלק של הליך כירורגי. לאחר ההסרה של העצב, המתת חסד בבעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה.</li>
</ol>2. אוסמיום ארבע-חמצני טיפול והטבעה שרף
<ol><li>פוסט קיבעון, בזהירות הסר כל שומן הנותרים ואת רקמות החיבור העצב, השימוש באזמל חד לחתוך את העצב למקטעים כ 5 מ מ אורך (עצב מקטעים יכולים להיות מופרדים ומתויגים צינורות שונים). להכין טרי 2% אוסמיום ארבע-חמצני מדולל בפתרון לשבועיים של דונלד טראמפ ולשמור שפופרת זכוכית. לטבול עצב קטעים ב- 2% אוסמיום ארבע-חמצני כבר שעתיים, אשר יכול להיות צינורות פלסטיק עבור פרק זמן קצר זה. הערה: צינורות פלסטיק מסוימים מגיבים עם אוסמיום ארבע-חמצני, גורם הכהיה של הפתרון, אז אחסון ממושך של אוסמיום ארבע-חמצני צינורות פלסטיק אינו מומלץ.</li>
	<li>באמצעות אפוקסי של הטמעת ערכת בינוני, להכין את הנוסחה ההטבעה הסופי:<ol>
<li>לערבב את אפוקסי הטבעה בינוני עם פתרון DDSA (אנהידריד dodecenylsuccinic; תערובת A) ומערבבים את אפוקסי הטבעה בינוני עם פתרון NMA (אנהידריד methylnadic; תערובת B). תן שתי תערובות A ו- B לערבב לפחות 20 דקות על ידי ערבוב עם פגים.</li>
		<li>מיד לפני השימוש, לערבב תערובת A ו- B, להוסיף את המאיץ DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) ביחס של 1.5 על 2.0% מהנפח הכולל של התערובת. שימו לב כי הפתרון DPM-30 יש למדוד בדיוק כדי למנוע את הבלוק צבע כהה ופריך. שרף כל כימיקלים רעילים; תשמרי תוספת למניעת מגע עם העור או באינהלציה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות צינורות 1.5 mL, לשטוף את העצב מקטעים עם PBS ולהתחיל את תהליך התייבשות על-ידי הצבת את מקטעי עצב שונים של אצטון/מזוקקים קטעים מים: 30%, 60%, 90%, ריכוז למשך 10 דקות ולאחר מכן ב- 100% אצטון 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד.  הערה שאתנול זה יכול לשמש במקום אצטון.</li>
	<li>חדירה שרף, למקם את מקטעי עצב בתערובת של 1 חלק התערובת הסופית ההטבעה, אצטון 100% חלק 1 במשך 30 דקות, ואז ב תערובת של 2 חלקי התערובת הסופית ההטבעה ו 1 חלק אצטון 100% למשך 30 דקות , סוף סוף מקום העצב מגזרים בגמר והטבעה התערובת במשך 30 דקות של.</li>
	<li>מכניסים את מקטעי עצב גומי סיליקון, בהטבעה בתבניות (אנחנו השתמשו 106 מ"מ אורך x 71 מ מ רוחב x 7 מ מ עומק; לחסום בגודל 11 מ"מ אורך x רוחב 6 מ מ x 3 מ מ עומק). להוסיף בעדינות את השרף על העצבים, מקפיד מכסה את מקטעי כל עצב, להימנע מביצוע בועות אוויר. להשאיר את התבנית המכילה עצב מקטעים לשרף פולימריזציה ב 60 מעלות צלזיוס במשך הלילה.</li>
</ol>3. חלוקתה על ידי Ultramicrotome
<ol><li>להכין סכינים זכוכית באמצעות מכונת הסכין זכוכית (איור 1B) ולעשות זכוכית סכינים עם סירות (איור 1C), אשר משמשות לאיסוף מקטעים עצב מרחפת על פני המים מזוקקים.</li>
	<li>המקום שרף מוטבע העצב בלוקים בעל ultramicrotome עם הצד הבסיסי פונה כלפי מעלה. באמצעות היקף ultramicrotome, לקצץ שרף עודף המקיפים את רקמת עצב, ולעשות את הבלוק מול צורה טרפז ובאשר קרוב לפני השטח האורך של עצב ככל האפשר באמצעות להב עם קצוות יחיד, כגון סכין גילוח. המיושמת על פני השטח האורך של המקטע עצב, אשר מוכרת על ידי שלה כתמים כהים מאת אוסמיום ארבע-חמצני. הערה: זמירה של שרף עודף יקטין את האזור של שרף להיות למחלקה ולשפר ביצועים להב, חיתוך בשלבים הבאים.</li>
	<li>שימוש של ultramicrotome, גורם חתכי רוחב במספר מספיק כדי לחשוף את משטח אחיד חתך של רקמת עצב באמצעות סכין זכוכית פשוטה. ברגע זה נעשה, לעבור סכין זכוכית שסירתו מתמלא מים מזוקקים בטמפרטורת החדר והתאימו את ultramicrotome ל- 1-2 μm לחתוך קטעים דק.</li>
	<li>להעביר חלקים דקים הצפים מהסירה הסכין זכוכית טיפת מים יונים בשקופית זכוכית באמצעות לולאה מתכת (איור 1D). יבש שקופיות המכילה סעיפים על-ידי העברת מספר פעמים מעל להבה לכמה שניות, מקפיד לא לחמם יותר מדי את המקטעים. כתם סעיפים יבשים מיד עם טולדין כחול או לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר ימים לפני צביעת. הערה: סעיפים גם ניתן לייבש בעזרת צלחת חמה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. תהליך ייבוש איטי הופך את הסעיפים חלקה.</li>
</ol>4. טולדין כחול מכתים
<ol><li>להכין 1% פתרון של טולדין כחול על ידי המסת 2 גר' נתרן בוראט ב- 100 מ של מים יונים, ואז מוסיפים 1 גר' טולדין כחול ומערבבים עד התפרקה. לסנן את הפתרון באמצעות נייר סינון (גודל הנקבוביות: 11 מיקרומטר) לשמור את הפתרון בבקבוק אטום בטמפרטורת החדר עד שבועיים.</li>
	<li>באמצעות פיפטה פלסטיק או pipettor מיקרו, להוסיף טיפה של פתרון טולדין כחול על הסעיפים עצב ולהשאיר עבור s 20-30.</li>
	<li>לשטוף כל פתרון טולדין כחול עודף בטבילת בעדינות את השקופיות לתוך צנצנת של מים יונים וחזור 3 - 4 פעמים עד סעיפים ברורים. יבש את שקופיות לפחות 15 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, או למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז מכסים את הסעיפים עם coverslip שימוש קבוע הרכבה בינונית. לבחון את השקופית הממוסגרת מיד או לאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לבדוק תחת מיקרוסקופ אור. עדשה טבילה 100 X שמן מומלץ תמונות מפורט המשמש לחישוב g-יחסי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים.

בדיקות של המבנים מורפולוגי של פגיעה במערכת העצבים ההיקפית והתחדשות הינם נושאים תכופים של המחקר13. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה עבור נתונים היסטולוגית quantifications באמצעות רקמות בעצב חולדה בתוך גושי שרף, מוכתם טולדין כחול. טכניקה זו מספקת תמונה של עצב מורפולוגיה שבו ניתן לכמת את התחדשות עצבים על ידי מדידת מספר אקסונים, מידת myelination, נוכחות של רקמת שהותירה infiltrative ואת העצבים בריאות. בעוד התמונות להראות חלוקתה, עיבוד של עצבים שציווית דגימות, אותם צעדים וחומרים החלות על העצבים הפצועים ואת העצבים מחדש עם תעלות או רקמות השתלים, בתנאי באותו הקיבעון של הרקמה היא נאותה20, 21.
בעוד כל השלבים של הפרוטוקול הם חיוניים, כמה שלבים אלה נוטים יותר להוביל מקטעים באיכות ירודה או תמונות. לא מספיק רקמות התייבשות עלולה להוביל חורים הסעיפים חוצפה (איור 5B). הסבר אפשרי אחד הוא immiscibility של שרף עם מים, המים העודפים ברקמה מונעת שרף שחדר הרקמה. לכן, המאפשר מספיק זמן השימוש של אצטון המוחלט הוא הכרחי כדי להבטיח צעד ראוי התייבשות. למרות שאנחנו בשימוש אצטון פרוטוקול זה, גם ניתן להשתמש אתנול. שרפים רבים, עם זאת, הם לא תגובתי עם אתנול, כך הרקמה חייבים להיות מטופלים עם פרופילן אוקסיד כדי לשמש מעבר בין התייבשות אתנול והטבעה שרף.
בשל עוביו הדק של הסעיפים, העברת עצב חלקים מהסכין זכוכית השקופית זכוכית צריך להיעשות בזהירות גדולה (איור 5C). 1-2 מקטעים μm הם מאוד שבירים, העברה לא תקין של הסעיף עלול לגרום המקטע לשבור. אם המקטע נאסף בחלק המרכזי של המקטע עם מחט, המקטע נוטה מתקפל לתוך עצמו, לעתים קרובות יהיה קשה להתגלות בעת העברת לשקופית. ניתן להשתמש בכלים שונים להעברה של המקטע לשקופית זכוכית, כולל מחטים ולולאות, כל אחד צריך להיבדק למשתמש ספציפי לקבוע אשר תניב ההעברה הטובה ביותר תוצאות. למטרות שלנו, באמצעות לולאה זה יכול להקיף את כל האגף מאוד מופחת קיפול של מקטעים כאשר הם הועברו מכלא הסכין זכוכית השקופית מיקרוסקופ (איור 1D).
באופן כללי, טיפול נאות של העצבים חיוני כמו דחיסה של העצבים יכול לגרום סדקים להתרחש בסעיפים עצב (איור 5A). דחיסת רקמת עצב יכול להתרחש במהלך העברה של עצב מקטעים בתהליכי חשיפה חיה, קיבוע, התייבשות, שרף הטבעה. כדי למנוע דחיסת רקמת עצב, העצב מקטעי יועברו על ידי מלקחיים בסדר, עליתי על קצה אחד של המקטע באופן אידיאלי על ידי רק את השכבה epineurial, אז העצב כולו לא יושפעו. הנוכחות של סדקים וקווים (סימני הסכין) בסעיפים עצב עלול להתרחש גם בשל הזכוכית משעמם או שימוש מופרז סכינים. כדי להבטיח חלוקתה אופטימלית, אנו ממליצים על ביצוע זכוכית טריים סכינים ולשנות את הסכין זכוכית ש-25-30 כל הקיצוצים, פחות אם חלוקתה דרך עצב עטוף בתוך צינור.
שרפים יכולה להיות יקרה יחסית, אינם הולמים כאשר סעיפים האורך עצב נדרשים, באפשרותך לדרוש בכלים יקרים כגון ultramicrotome ומכונת הסכין זכוכית. למרות מגבלות אלו, טולדין כחול צביעה של שרף מוטבע היקפיים עצב חלקים עדיין נחשב את תקן זהב עבור ויזואליזציה של חתכי רוחב של העצבים ההיקפית morphometry4,5. סעיפים האורך גם יכול לחשוף את התכונות החשובות של העצבים ההיקפיים, כגון המשכיות עצב Ranvier של צמתים, אך שימושית ביותר עם אימונוהיסטוכימיה. במקרים כאלה זה הנוהג הכללי לעבד באופן שונה שני מקטעים של אותו עצב, אחד עבור טולדין כחול חתכי רוחב והשני עבור אימונוהיסטוכימיה האורך. בשל מקרים מוגברת של העצבים ההיקפית טראומה ופגיעות ואת הצרכים של דרך טובה יותר להעריך מבנים מורפולוגיים עצב, שיטה זו תוכל להמשיך להיות מיושם ככלי חיוני כדי לקבל נתונים היסטולוגית של נזק עצבי והתחדשות.

העצבים ההיקפיים להרחיב בכל הגוף, innervating ברקמות היעד עם אקסונים מוטוריים או חושי1. ליקויים במערכת העצבים ההיקפית הנגרמת על ידי הפרעות רפואיות, טראומה מייצגים בעיה מרכזית בבריאות הציבור ויש השפעות כלכליות גדולות2,3. למרות ההתקדמות הערכת התוצאות של פגיעות במערכת העצבים ההיקפית והבנה התחדשות עצבים, שיטות מסורתיות כגון עצב היסטולוגיה וצביעת טכניקות הן כלי חשוב להעריך איכותית, באופן כמותי עצב בריאות כמידה התוצאה מסוף חייתיים או רקמה אנושית נכרת. זה לעתים קרובות מזווג עם מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פונקציה במערכת העצבים ההיקפית, איפה morphometry יכול לגלות למה עצב פונקציונליים התחדשות עשה או לא התרחשה.
טולדין כחול מכתים סעיפים שרף מוטבע למחצה דק במערכת העצבים ההיקפית היא שיטה מיוחדת הדמיה סיבי העצב סיבי עצב, אספקת באיכות גבוהה ונקה תמונות מפורט של עצב מבנים4,5,6 . טולדין הכחולה הכתם metachromatic acidophilic, התגלה על ידי ויליאם הנרי מין הולל ב- 1856-7, כבר בשימוש ביישומים רפואיים מספר8. טולדין blue מוכתמת במערכת העצבים ההיקפית מקטעים המתקבל מקטעי עצב שרף-מוטבע מאפשר הדמיה ברורה של עצב מבנים. הדמיה של מבנה המיאלין יכול להיות מוגברת על ידי השימוש אוסמיום ארבע-חמצני קיבוע שאחרי4,9. אוסמיום ארבע-חמצני הוא רעיל חמצון של שומנים בדם מקבע סוכן המקיים אינטראקציה עם קשרים כפולים בשומנים, וכתוצאה מכך וליישובים מוגדר השומנים-עשיר המיאלין מעילי פרווה10 עם זאת, אוסמיום ארבע-חמצני רעיל, יקר, דורש של דגירה ארוך יותר של מקטעים עצב, הוא לא תמיד.
שיטות אלטרנטיביות של עיבוד, צביעת פותחו עבור ויזואליזציה של מורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית; פרפין חלוקתה קריוגני, אפוקסי שרף-מוטבע עצב חלוקתה ואחריו מכתים עם טולדין כחול או פתרון phenylenediamine שימש לכמת שינויים מורפולוגיים במערכת העצבים ההיקפית התחדשות 11,12 . שיטות אלה כל יש יתרונות שלהם ועל הנתונים החיוניים התשואה על מספר אקסונים, עובי המיאלין, קוטר האקסון, קוטר האקסון סיבים סיבי העצב קוטר (g-יחס) 11,13,14,15 .
ההבחנה העיקרית שרף-הטבעה של פרוטוקול זה הוא כי הוא מקל קבלת חתכים עובי של 1-2 μm בשל הקושי של השרף תוך שמירה על התכונות היסטולוגית של העצב. סעיפים אלה דק, בניגוד הסעיפים עובי μm 4-5 המתקבל פרפין הטבעה, לספק במערכת העצבים ההיקפית מקטעים עם רזולוציה גבוהה יותר, ומאפשר כימות מדויקת יותר של האקסון myelination, כגון g-היחס, זה לא יכול להיות להשיג חלקים עבה16. בזמן ההקפאה חלוקתה יכול לשמש כדי להשיג את סעיפים 1-2 מיקרומטר, עברו את החוויה שלנו כי קשה יותר להשיג חלקים ללא סדקים גדולים רבים. קטעים סדוק כאלה יכולים לגרום ספירה מדויקת של המספר של אקסונים והיבטים של myelination.
בנוסף טולדין כחול מכתים17, כסף מכתים שיטת18 ומאסון מוכתמים trichrome4 יכול לשמש גם להראות אומץ אקסונים. עם זאת, באמצעות שרף הטמעת סעיפים עצב התווך עכברוש מוכתם או hematoxylin אאוזין או מאסון trichrome עטיפות המיאלין הראה חלש ו מבנים לא מזוהה, ואילו טולדין כחול מכתים הראו תמונה ברורה מעטפת המיאלין והוא יכול בקלות להיות כימות4. למרות מספר מגבלות, העצבים טולדין כחול מכתים של שרף מוטבע היקפית היא טכניקה יקר יכול לשמש כאשר תמונות ברזולוציה גבוהה של עצב מורפולוגיה נדרשים.
החיסרון העיקרי להטבעת שרף הוא כי זה זמן רב, אינו מאפשר immunostaining של הרקמה אותו בשל הקושי של אנטיגן אחזור בהשוואה פרפין וטכניקות מקטעים מוטבע קפוא. לכן לא לרוב ניתן לנצל את הרקמה זהה עבור immunostaining שמעובד באמצעות שרף-הטבעה על צביעת טולדין כחול. אמנם לא היה כאן, אם אימונוהיסטוכימיה רצוי שרף מקטעים מוטבע, השימוש methacrylate גליקול הטבעה שרפים מאפשר אימונוהיסטוכימיה להתבצע על מקטעי רקמת, אבל זה יקרה יחסית19. זה יכול להיות מעט חמאני חיתוך העצב ההיקפי לתוך מקטעים נפרדים, חלקם להטבעת שרף ואחרים עבור immunostaining ישירות לאחר קיבוע.
התהליך של טולדין כחול צביעה של שרף מוטבע העצבים ההיקפיים, כמו עם ניתוח histopathological ביותר, יכול להיות שבור לתוך חמישה שלבים, כולל קיבוע, התייבשות, הטבעה, חלוקתה, צביעת20. אנו שואפים כאן מספקים פרוטוקול ו מנחה מעשית לשימוש בשרף עכברוש מוטבע בעצב סעיפים מוכתמים טולדין כחול לרכוש תמונות באיכות גבוהה.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffer Saline</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Tetraborate Decahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Embedding Medium Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>To adjust Trump&#039;s fixative pH</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Maker</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC Products</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Glass Vial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>For trimming resin block</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td>For picking up thin resin sections</td></tr><tr><td>Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Oven</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>6350115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL plastic pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Micro-surgical Kit</td><td>World precision instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td></tr></tbody></table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

העצבים ההיקפיים להרחיב בכל הגוף, innervating ברקמות היעד עם אקסונים מוטוריים או חושית. עקב הפצה נרחבת, העצבים ההיקפיים נפגעים לעתים קרובות בגלל טראומה או מחלה. כמו שיטות ואסטרטגיות פותחו כדי להעריך את הפגיעה במערכת העצבים ההיקפית במודלים של בעלי חיים, הפונקציה והתחדשות, לנתח את morphometry של עצב היקפי הפך מדידה תוצאה מסוף חיוני. מקטעים טולדין כחול צביעה של עצב קרוס שהושג ממקטעים עצב שרף מוטבע הוא שיטה ישימה עבור הערכות כמותיים של העצבים ההיקפיים, המאפשר ויזואליזציה של מורפולוגיה מספר אקסונים ומידת myelination. טכניקה זו, כמו עם שיטות היסטולוגית רבות אחרות, יכול להיות קשה כדי ללמוד ולעבוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים בכתב. הכוונה של פרסום זה לכן כדי להדגיש פרוטוקולים בכתב עבור טולדין כחול צביעה של העצבים ההיקפיים עם צילום וידאו של השיטה, באמצעות העצבים ממוגלה שנקטפו חולדות. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים ויוו עצבים היקפית קיבוע ואוסף של רקמות, וכן קיבוע שאחרי עם 2% אוסמיום ארבע-חמצני, הטבעה של עצבים שרף אפוקסי, ultramicrotome חלוקתה של עצבים עד עובי 1-2μm. עצב חלקים לאחר מכן הועבר זכוכית, מוכתם כחול טולדין, אחרי אשר הם נמצאים באופן כמותי ובאופיו העריך. דוגמאות הבעיות הנפוצות ביותר מוצגות, כמו גם צעדים להקלת בנושאים אלה.

שרף מוטבע במערכת העצבים ההיקפית סעיפים מוכתמים טולדין כחול לאפשר נתונים מדויקים היסטולוגית quantifications. סקירה כללית של התהליך מוצג (איור 2). סעיפים ממוגלה העצבים נעוץ שרף בינוני ו מוכתם טולדין כחול הראה ברור תמונות ברזולוציה אופטימלית (3 ספרות). נזק עצבי יכול לגרום שינויים רבים עצב מבנים מורפולוגיים, לדוגמה, שינויים סיבי עצב, קוטר האקסון ואת עובי מעטפת המיאלין. בשיטה זו ניתן לשמור על מבנה העצב בצורתו הטבעית, אשר מקלה על המידה של מספר פרמטרים כמו היחס בין קוטר האקסון עד לקוטר סיבים הכולל (g-היחס; איור 4). מגוון גורמים יכול להוביל מקטעים אופטימליות במערכת העצבים ההיקפית, כולל הנוכחות של סדקים (איור 5A) במקטע עקב טיפול לקוי של העצב. חורים יכול להתרחש גם בסעיף (איור 5B) עקב התייבשות לא מספיקות. שגיאה אפשרית נוספת בהליך זה מתקפל הסעיפים (איור 5C), אשר ניתן לתקן באמצעות לולאות לחסן עבור סעיף העברת אותן לשקופית זכוכית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig1.jpg"> איור 1: ניתוח ואת חלוקתה. (א) תאים עכברוש בעצב במהלך ויוו קיבעון. (B) זכוכית הסכין maker (ג) זכוכית סכינים עם הסירה. (ד) לולאות מתכת המשמש להעברת צף מקטעים דק של הסכינים זכוכית על טיפה של מים יונים על זכוכית. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig2.jpg"> איור 2: סכימטי של השיטה שבה נעשה שימוש בפרוטוקול זה. (א) למבוגרים Dawley ספראג עכברוש הוא מורדם, ואחריו ויוו עצב קיבעון (B) , עצבים אוסף (C). השלב הבא הוא קיבוע שאחרי עם 2% אוסמיום ארבע-חמצני (ד) ושרף הטבעה (E). שרף עצב מוטבע שמקטעים הם גזוז (נ) ואז המחולקת למקטעים (G) באמצעות ultramicrotome של. לבסוף, עצב חלקים בשקופית זכוכית מוכתמים טולדין כחול (H). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig3.jpg"> איור 3: סעיף רוחבי עכברוש בעצב מוכתם טולדין הכחול. מראה המקטעים תחת הגדלה שונים (10 X 20 X, 40 X, 60 X) של תמונה ברורה עם רזולוציה מיטבית. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig4.jpg"> איור 4: סעיף רוחבי עכברוש בעצב מוכתם טולדין הכחול. זו התמונה ברזולוציה גבוהה (100 X) יכול לשמש כדי למדוד את היחס בין קוטר האקסון עד לקוטר סיבים הכולל (g-היחס). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig5.jpg"> איור 5: קטעי רוחבי עכברוש בעצב מוכתם טולדין כחול תחת הגדלה שונות. הראו העברינים הבעיות ייתכן נתקל במהלך הביצוע של פרוטוקול זה. (א) ו- (B). הנוכחות של סדקים וחורים בתוך המקטע עצב הנגרמת על ידי טיפול לקוי של המקטע והתייבשות לא מספיקות של הרקמה, בהתאמה. (ג)-הרמוניקה המקטעים, אשר עלול לקרות במהלך העברת הסעיפים הסכינים זכוכית לשקופית. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58031/58031fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמחיש ומבנים של העצבים ההיקפיים על ידי קבלת מכתימה את סעיפים 1-2 מיקרומטר עם טולדין כחול

טולדין כחול מכתים סעיפים שרף-מוטבע להערכת המורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.8K Views.  University of Wyoming. כאן אנו מציגים פרוטוקול להמחיש ומבנים של העצבים ההיקפיים על ידי קבלת מכתימה את סעיפים 1-2 מיקרומטר עם טולדין כחול

Video: Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Medicine

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Developmental Biology

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

הקמת מודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים טהור עם אגוניסט Ultrapotent פוטנציאלי קולטן ארעי Vanilloid סוג 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

טולדין כחול מכתים סעיפים שרף-מוטבע להערכת המורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שילוב של צבע lipophilic, באתרו, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה