זנים C. elegans השתמשו במחקר זה התקבלו ממרכז גנטיקה Caenorhabditis, אשר נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים - Office של תשתית תוכניות מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי NIH: 1R03AG048578-01 Jun ליאנג, הנטר-CCRG 1501 Jun ליאנג ולאחר PSC-הנטר 66184-00 44 ו-45 67248-00 Jun ליאנג. אנו מודים קאתי סבג-דאן בטובך לחלוק לה מרחב מעבדה. כל התמונות פלורסצנטיות נאספו במתקן הליבה במכללת קווינס. אנו מודים וויליאם ג'יי רייס על הערותיו על כתב היד.

1. פתרונות
<ol><li>
NGM צלחות
	<ol>
<li>בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל', הוסף דור 3 של NaCl, 17 גרם אגר, 2.5 גר' Peptone 975 מ ל dH2O. כיסוי הפה + בקבוקי שתייה צידניות עם רדיד אלומיניום. אוטוקלב. הבקבוק עבור 50 דק לצנן את זה 20-30 דקות.</li>
		<li>לאחר מכן להוסיף פתרונות סטיריליים: 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל אתנול, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 25 מ של 1 מ' KPO4 (pH 6.0) מאגר. מערבולת הפתרונות לערבב אותם היטב.</li>
		<li>באמצעות מתקן נוזלי, לוותר על הפתרון NGM צלחות פטרי 60 מ מ. מילוי הלוחות 2/3 מלא של אגר. לאחסן אותם לאוויר ב 4 ° C לשימוש עתידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 מ'-KPO-4 -מאגר (pH 6.0)
	<ol>
<li>להמיס g 10.832PO ח'4 ו- g 3.56 של K2HPO4 dH2O, ולאחר מכן לכוונן את עוצמת הקול סה כ 100 מ. אוטוקלב הפתרון למשך 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>להמיס דור 3 ח'2PO4, 6 גר' נה2HPO4ו- 5 גר' NaCl dH2O, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, ולכוונן את העוצמה הכוללת כדי 1 ל'</li>
	</ol>
</li>
	<li>
µg 10/mL דאפי
	<ol>
<li>להוסיף 1 µL של 10 מ"ג/מ"ל של דאפי לתוך µL 999 של dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
95% אלכוהול (v/v)
	<ol>
<li>למדוד 95 מ"ל של 100% אלכוהול ומוסיפים מים מזוקקים כדי לכוונן את העוצמה עד 100 מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
30% אצטון (v/v)
	<ol>
<li>להוסיף 30 מ של אצטון dH2O ולכוונן את העוצמה סה כ 100 מ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. עומס חום
<ol><li>ליצור קו מערך extrachromosomal עם מבנה translational של היעד גנים9,10. לחלופין, להשיג קווים אלה מן את Caenorhabditis גנטיקה מרכז (CGC), שהינו משאב ציבורי למחקר C. elegans , או מעבדת מחקר שפורסמו בעבר.</li>
	<li>לשלב את הקווים extrachromosomal הגנום על ידי חשיפת תולעים קרינה-γ Rad 3,8009. לאחר מכן, בחר את הקווים stably ביטוי כך כל בעל חיים מבטא סמן חלבון כגון GFP או רולר.</li>
	<li>כדי להסיר מוטציות שנוצרו במהלך הקרינה, outcross לפחות 2 שורות x. להשתמש הקו הטרנסגניים כדי לזהות שינויים דפוס ביטוי חלבון תחת לחץ.</li>
	<li>הכינו צלחות תולעת NGM כפי שמתואר בשלב 1.1. פסים של שיבוט OP50, התרבות החיידקים בתוך נוזל ציר LB בן לילה. זרע צלחות NGM עם נוזלי OP50 תרבות, דגירה הצלחות בחממה 37 ° C בלילה כדי לגדל דשא חיידקים כמקור מזון לתולעים לקרר את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש.</li>
	<li>לגדול הקו הטרנסגניים ב- 20 ° C ללא רעב במשך לפחות 2 דורות לפני וזמינותו מתח חום.</li>
	<li>לבחור 8-10 בוגרים gravid (רחם מלא ביצים) צלחת תולעת חדש, אז תן להם להטיל ביצים במשך כ- 3-5 h ולהסיר כל המבוגרים הצלחות.</li>
	<li>כדי לסנכרן את התולעים, תן את הביצים בוקעות ולגדול הזחלים עבור-48 שעות. כדי השלב הרביעי (L4) זחל. לבחון את מבנה הפות שלהן (מבנה חצי ירח) כדי לזהות את הבמה (איור 1, חץ) L411.</li>
	<li>מקום צלחות תולעת עם הזחלים L4 חממה 35 ° C עבור 2 – 5 h להשיג עומס חום. מקום מד חום כדי למדוד במדויק את הטמפרטורה בחממה.</li>
</ol>3. דאפי מכתים
<ol><li>
קיבוע אתנול
	<ol>
<li>להוסיף 10 µL של המאגר M9 במרכז של זכוכית.</li>
		<li>לבחור את התולעים בהלם-חום מהשלב 2.8 ולשים אותם לתוך המאגר M9 בשקופית זכוכית.<ol>
<li>לחלופין, לשטוף את הצלחת עם M9, centrifuge זה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולמחוק את תגובת שיקוע. הוסף את התולעים לשקופית זכוכית.</li>
		</ol>
</li>
		<li>השתמש רקמה רכה כדי לנקז את הנוזל העודף. . זהירות מהמדרגה תחת מיקרוסקופ ויבתר...</li>
		<li>להוסיף 10 µL של אלכוהול 95% על התולעים, ייבש אותן בחוץ. לצפות בתהליך תחת מיקרוסקופ ויבתר, אל תתנו לחיות לתפוס יבש מדי. מיד לאחר האתנול התאדו מן החיות, המשך לשלב הבא. הערה: אתנול מתאדה מהר מאוד.</li>
		<li>חזור על שלב 3.1.4 פעמיים כך התולעים הם קבועים. הערה: זה נורמלי עבור בעלי החיים להיראות כהה יותר, מעוותת.</li>
		<li>להוסיף 10 µL של דאפי (10 µg/mL) את התולעים. מיד לכסות אותם עם coverslip ויסגור את השקופית הכוללת ג'ל לק שקוף.</li>
		<li>להציג את החיות לאחר כ 10 דקות על ידי קרינה פלואורסצנטית המיקרוסקופ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קיבוע אצטון (גישה אלטרנטיבית)
	<ol>
<li>לשטוף את הצלחת בהלם-חום משלב 2.8 עם M9, centrifuge זה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של dH2O, לאסוף את צניפה, ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 400 µL של 30% אצטון עבור 15 דקות צנטריפוגה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים את תגובת שיקוע. השתמש µL 500 של dH2O לרחוץ את החיות 2 x. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של דאפי (10 µg/mL), או 4 x כמות האחסון של התולעים הכולל, בצינור למשך 15 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 1000 g עבור 1 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. לשטוף את צניפה 2 x עם 500 µL של dH2O. למקם את התולעים בשקופיות זכוכית, לכסות אותם עם coverslips, לאטום את השקופית הכוללת ג'ל לק שקוף, ולבחון את החיות תחת מיקרוסקופ זריחה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מיקרוסקופיים הדמיה
<ol><li>הפעל את מקור האור UV ומיקרוסקופ זריחה. הפעל את המחשב מחובר המיקרוסקופ.</li>
	<li>לטעון את השקופית על המיקרוסקופ זריחה. השתמש עדשה המטרה צריכת חשמל נמוכה (10 X) כדי לאתר את התולעים, להגדיל את כוח ההגדלה 400 X ולהתמקד הדגימה.</li>
	<li>פתח את התוכנה המצורפת עם המיקרוסקופ. לחץ על "רכישת" בתפריט; לחץ על "המצלמה" ובחר את המצלמה מחוברת המיקרוסקופ; פעולה זו מאפשרת המצלמה שנבחר לתקשר עם התוכנה. הערה: מיקרוסקופים שונים עשויים להשתנות במבצע.</li>
	<li>תחת אותו "רכישת", לחץ על "רב-ממדי רכישה". פעולה זו פותחת חלון חדש של ניווט "רב-ממדי רכישה". לחץ על לחצן "רב-ערוצי", והם יופיעו כל הערוצים הזמינים.</li>
	<li>בחר כחול, ירוק, DIC (התערבות דיפרנציאלית חדות) כדי לבחון את הדגימה. בחלון הניווט "רב-ממדי רכישה", להשאיר את "כחול-דאפי", "גרין-GFP", וערוצי "גריי-DIC", "Nomarski" לחץ לחיצה ימנית על ערוצים אחרים, כגון "אדום-rhodamine" ו- "שדה לבן בהיר", לסגור אותם.</li>
	<li>
ראשית, למדוד את זמן החשיפה לכל ערוץ:
	<ol>
<li>שמאל לחץ בערוץ 'בלו-דאפי' כדי לבחור אותו ולאחר מכן לחץ על "מדד" על מנת לקחת את תמונת חיים תחת בערוץ דאפי עם הזמן חשיפה אוטומטית. יופיע חלון חדש עם תמונת בשידור חי.</li>
		<li>בצד שמאל של החלון תמונות בשידור חי, כוונן באופן ידני את זמן החשיפה במידת הצורך להפוך את התמונה כרצונכם.</li>
		<li>לבסוף, לחץ על "אישור" בחלון התמונה בשידור חי. פעולה זו מגדירה את זמן החשיפה תחת בערוץ דאפי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על צעד 4.6 הערוצים האחרים, "ירוק-GFP" ו- "גריי-DIC", "Nomarski", כדי להגדיר את זמני חשיפה עבור ערוצים אלה.</li>
	<li>בחלון הניווט "רב-ממדי רכישה", לחץ על "התחל" כדי לאסוף באופן אוטומטי תמונות 3 תחת 3 ערוצים שונים לפי סדר (ראה לעיל) עם פעמים חשיפה ספציפי כפי שנקבע.</li>
	<li>כדי לשמור את הקובץ, ללכת לתפריט הראשי, לחץ על "קובץ" ואז על "שמירה בשם". קלט שם הקובץ ואת שם התיקיה. שמור את הקובץ כתבנית קובץ ברירת המחדל כדי לשמר מידע הדמיה מפורטת לשימוש עתידי.</li>
	<li>
כדי לייצא את הקובץ בתבניות אחרות:
	<ol>
<li>ללכת "קובץ" ולחץ על "ייצוא". פעולה זו תפתח את חלון הגדרות ייצוא.</li>
		<li>להגדיר שם קובץ ותיקיה. בדוק "ליצור תיקיית פרויקט" טוב יותר לארגן את הנתונים. התוכנה גם מאפשרת למשתמש לציין 4 אפשרויות אחרות: "צור מיזוג תמונות", "השתמש צבע לתמונות ערוץ", "שימוש ערוץ שמות", "תמונה ממוזג בלבד".</li>
		<li>בחרו סוג הקובץ הרצויה מהתפריט הנפתח, כגון "טיף", "BMP", "PSD", או "JPG" וסוגים אחרים. ואז לחץ על "התחל" כדי לייצא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor%2FDAF-16%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release%2C+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1%2FFas+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li>
<li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins%3A+a+20-year+stock-take%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li>
<li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+%28Placozoa%29%2C+an+animal+lacking+neurons+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905(2018).</li>
<li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+%28ROS%2FRNS%29+during+hypersensitive+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li>
<li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043678">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li>
<li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308(2017).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li>
<li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer%3A+surprising+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li>
<li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene%2C+CLIC4%2C+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378(2012).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li>
<li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929(2014).</li>
<li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li>
<li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li>
<li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1%2FBECN1%2FBeclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li>
<li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+environment%2C+DAF-7%2FTGFbeta+signaling+and+LAG-2%2FDSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li>
<li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+helicase+HIM-6%2FBLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li>
<li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li>
<li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li>
</ol>

המחברים יש ריהצהל.

מאמר זה הציג שיטה מהירה ויעילה כדי לוודא שינויים subcellular חלבון של הציטופלסמה את הגרעין. הביטוי חלבון הוצג על ידי היתוך GFP, בעוד המבנה גרעין אומתה על ידי דאפי מכתים (איור 3). מאז immunostaining C. elegans חלבונים הוא מאתגר, הגרסא subcellular המקומית חלבון C. elegans רוב מאופיינים על-ידי תיוג אותם עם סמן חלבונים כמו GFP, לאז, mCherry ואחרים18,19 , 20 , 21. במאמר זה, שימש gfp כדי לתייג את ג'ין היעד טקרמ-1 כדי להדגים לוקליזציה הסלולר שלה חלבון. כדי לוודא ההתאמה גרעינית, דאפי מכתים שימש. בשתי שיטות חלופיות הוצגו על ההכתמה דאפי. שניהם ביעילות הראה גרעין חזק תולעים בתוך מסגרת זמן עבודה הגון (פחות מ 1 h). הקיבעון אתנול מתאים אוסף מדגם קטן כגון תצפית איכות (איסוף תולעים פחות מ- 50). מניעת התולעים ייבוש לחלוטין הוא המפתח. ברגע 95% אלכוהול מתאדה מן התולעים, המשך לשלב הבא מיד. הקיבעון אצטון מתאים אוסף דגימה בקנה מידה גדול כגון ניתוח כמותי (איסוף חיות יותר מ-50). עם זאת, בשל הצעדים מרובים לרחוץ את המדגם, הדגימה כמה יאבדו. לכן, מומלץ מאוד בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, שומרים על תולעים רבים ככל האפשר. ברגע שהם חתומים, שקופיות הנובע אצטון קיבוע ניתן לאחסן במשך שבוע ב 4 º C.
פרוטוקול זה ניתן לכוונן לחלבונים אחרים מעניינים לעקוב אחר שינויים לוקליזציה subcellular. בנוסף עומס חום המובאת כאן, מבחני הלחץ אחרים יכול להיות מוערך, כגון סטרס חמצוני, מתכות כבדות מתח, הגבלות דיאטטיות ואחרים. שינוי לוקליזציה subcellular חלבון יכול להיבדק גם על ידי שינוי הרקע הגנטי של החלבון עניין. למשל, הקו הטרנסגניים ניתן חצה על הרקע של מוטציה שונים, כך ניתן לזהות את האינטראקציה הגנטית הרומן. גם יכול להיות מיושם התערבות ב RNA (RNAi) כדי להפיל גנים ספציפיים לחקור את השינוי לוקליזציה subcellular חלבון שנוצר. יישומים אלה הם עניין גבוהה כדי לזהות רכיבים רגולטוריות הרומן. עבור חלבון לא ידוע, התנאים ניסיוני השונים צריך להיבדק, כגון ריכוז ריאגנט הבדיקה, משך הזמן דחק, בשלבים התפתחותיים ספציפי של התולעים. במחקר שלנו, ניסינו משכי זמן שונים, בין 30 דקות ל- 5 שעות, וטמפרטורות מתח של חום שונות. הלם חום ב 35 ° C עבור 3 h מדגים בבירור חלבון גרעיני התקה.
יישומים נוספים של דאפי מכתים לכלול הבחינה של תהליך מיוזה מיטוזה תולעים, במיוחד ב germline תאים22,23,24,25, ספירה של מספר גרעינים ב של מוטציות גנטיות רקע20,26,27.

שינוי של לוקליזציה subcellular חלבון הוא מנגנון משותף בתגובה לאותות פנימיים או חיצוניים כגון עומס חום, הרעבה, סטרס חמצוני, אפופטוזיס, זירחון חלבונים ועוד. לדוגמה, עומס חום גורם שייך FOXO הדף היומי-16 רוברטסונית גרעיני1,2, ואת החלבון BCL-2 פרו-אפופטוטיים להיפגע שההצעה translocates המיטוכונדריה עם מותו המקבל איתות3,4. טכניקות שונות זמינים לזהות שינויים אלה. שילוב של סופג המערבי ובידוד מבחינה ביוכימית subcellular מבנים (למשל, המיטוכונדריה או הגרעינים) טוב להשיג את המטרה3. עם זאת, זה דורש של נוגדנים ספציפיים נגד החלבון עניין. לפיכך, נוגדן ומבוססת הופך המפתח להצלחה. גישה חלופית היא תווית שונה מבנים subcellular או organelles עם סמנים שונים כגון חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP), חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), חלבון פלורסצנטיות צהוב (YFP) mCherry, ולאחר בינתיים תווית החלבון של עניין עם סמנים אחרים. לאחר מכן, לבחון אותם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי למקם את מטרות5,6. איזוטופים רדיואקטיביים הינם בחירה חלופיים עבור תיוג חלבונים היעד וכן ואז זיהוי שלהם לוקליזציה subcellular7. עם זאת, שיטה זו מחייבת הכשרה מתאימה וטיפול פסולת רדיואקטיבית. בנסיבות כגון חוסר נוגדנים ספציפיים, העדר של סמן ראוי, או את scarceness של ציוד כגון מיקרוסקופ קונפוקלי, גישה אלטרנטיבית צריך להיחשב. כדי לזהות חלבונים גרעיניים התקה, זה מושך רק לסמן את היעד החלבונים עם סמן, כתם גרעינים עם הכימית כימית 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מאז זה רק דורש מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה.
Immunolabeling C. elegans עם נוגדנים הוא מאתגר בשל החדירות הנמוכה של קליפת או את הקוטיקולה סילוק המקיפים את החיה. בינתיים, מאז C. elegans חלבונים מתבדרת באופן משמעותי מן orthologs חוליות שלהם, כמה חברות מסחריות לספק C. elegans עם מוצרים ספציפיים. . קשה לי מעבדה קטנה ליצירת נוגדנים C. elegans עבור עצמם. חוקרים בקהילה מרבים להשתמש חלבונים מתויג כסמני להפגין ביטוי חלבון לוקליזציה או הגן. מאמר זה משתמש טקרמ-1::GFP בתור דוגמה לאתר חלבון התקה גרעיני תחת מתח חום8. משולב translational טקרמ-1::gfp לתוך הגנום בעלי חיים משמש לבטא stably את הגן עם gfp פיוז'ן. המחקר הראה שכי טקרמ-1 מתבטאת המעי, לגוף החומה שרירים אחרים מבני subcellular8. פרוטוקול זה מדגים כיצד לסנכרן תולעים. כדי השלב הרביעי זחל (L4), לבצע חום מתח הניסוי, ואת התנהגות דאפי מכתים, אתנול קיבעון, קיבוע אצטון, הדמיה במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well</td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>soft tissue</td></tr><tr><td>Zeiss&amp;nbsp; AX10</td><td>Zeiss</td><td></td><td>fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscope software</td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Zeiss</td><td></td><td>digital camera</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparent nail polish gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm petri dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-20 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;micro;L pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &amp;micro;L pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum wire worm pick</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecting protein subcellular localization by green fluorescence protein tagging and 4',6-diamidino-2-phenylindole staining in caenorhabditis elegans

זה פרוטוקול, קרינה פלואורסצנטית ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) צביעת משמשים כדי לעקוב אחר שינויים לוקליזציה subcellular חלבון; בפרט, התקה גרעיני תחת חום להדגיש תנאי. חלבונים מגיבים אותות בהתאמה עד חיצוניים ופנימיים. מנגנון משותף היא לשנות לוקליזציה subcellular שלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לעקוב אחר לוקליזציה חלבון שלא דורש נוגדן, תיוג רדיואקטיבי או מיקרוסקופ קונפוקלי. במאמר זה, משמש GFP כדי לתייג את היעד חלבון טקרמ-1 ב- C. elegans, חבר של משפחת חלבונים (CLICs) של ערוץ תאיים כלוריד כולל יונקים CLIC4. קו הטרנסגניים translational משולב טקרמ-1::gfp (עם מקדם מכירות ו רצף הגן המלא) נוצרה על ידי שינוי, γ-קרינה, stably מבטא את הגן gfp. מחקרים אחרונים הראו כי על עומס חום, סטרס חמצוני לא, 1::GFP טקרמ מצטבר בגרעין. חופפים את האות ה-GFP עם מבנה הגרעינים והן את דאפי אותות מאשר את השינויים לוקליזציה subcellular טקרמ-1 תחת לחץ... פרוטוקול זה מציג שתי שיטות קיבוע שונות דאפי מכתים: קיבוע אתנול, קיבוע אצטון. פרוטוקול מכתימים דאפי שהוצגו במאמר זה הוא מהיר ויעיל ושומר את האות ה-GFP והן את השינויים subcellular לוקליזציה של חלבון. שיטה זו דורשת רק מיקרוסקופ זריחה עם Nomarski, מסנן FITC מסנן דאפי. היא מתאימה עבור הגדרה מעבדה קטנה, סטודנט לתואר ראשון מחקר, מחקר תלמיד תיכון וכיתות ביוטכנולוגיה.

חלבונים תאיים ערוץ כלוריד (לחץ על כד) הם חלבונים רב תכליתי מאוד נשמרים על פני מינים12. הרבה מחקרים מראים כי CLICs לווסת לחץ הסלולר autophagy, אפופטוזיס, carcinogenesis, אנגיוגנזה, התגובה החיסונית מולדת מקרופאג מערכת בתרבית של13,14,15,16 ,17. ישנם שני ולחץ כדי לירות homologs C. elegans: טקרמ-1 וסיפורה ה-4. מחקר שנערך שלנו הראה שאת טקרמ-1 מווסת את ניהול מתח בעלי חיים8. אנו משולב בונה translational טקרמ-1::gfp לתוך הגנום בעלי חיים, יצירת קווי מהונדס, אשר stably אקספרס ג'ין טקרמ-1 עם GFP כסמן (איור 2A ו- 2B). תחת עומס חום, 1::GFP טקרמ מצטבר בגרעין באזור המעי מאז האות GFP חזקה חופף מבנה גרעין (איור 2 C -E). כדי לוודא ההתאמה subcellular, דאפי מכתים שימש גישה כתם הגרעינים. באמצעות אתנול קיבוע דאפי מכתימים מראה ברור האטומים בגוף בעלי החיים (איור 3B). אצטון קיבוע גם משיגה תוצאות דומות (איור 3E). האותות GFP, דאפי חופפים לאשר כי טקרמ-1::GFP אכן שנצבר הגרעינים באזור המעי (איור 3C, F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig1.jpg"> איור 1: תמונות של רבע זחל (L4) שלב C. elegans תחת הגדלה שונות כוחות. (א) 63 X, X (B) 115 ו- (ג) 400 X יכולת הגדלה. חצים הצבע על הפות של תולעת L4; הערה מבנה חצי ירח. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר בכל התמונות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57914/57914fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig2.jpg"> איור 2: תחת עומס חום, שמצטבר טקרמ-1::GFP הגרעינים של המעי. (א) Normaski תמונה של אזור המעי לפני הלם חום. (B) אות GFP חזק נצפתה באזור instestinal לפני הלם חום. (ג) Normaski תמונה של אזור המעי לאחר הלם חום (חיצים הצבע על הגרעינים של האזור מעיים). (ד) אות GFP חזק מצטבר לאחר הלם חום. (ה) חופפים תמונות של ה-GFP, Normaski. כל התמונות נלקחים עם יכולת הגדלה X 400. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר בכל התמונות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57914/57914fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig3.jpg"> איור 3: טרנסלוקציה גרעיני טקרמ-1::GFP יש אישור מאת דאפי מכתים. (א-ג) באמצעות אתנול קיבוע עבור צביעת דאפי. (D-F) באמצעות אצטון קיבוע עבור צביעת דאפי. A ו- D, צבע ירוק מראה אות GFP באזור המעי. B ו- E, הצבע הכחול מראה הגרעינים מאת דאפי מכתים. C ו- F מראים חופפים תמונות של ה-GFP, דאפי, Normaski. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר בכל התמונות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57914/57914fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
איור משלים: קיבוע אצטון משמרת את הדגימה של 60 יום לאחר קיבוע אצטון, אותות ה-GFP, דאפי מהן נצפות עדיין. (א) ירוק מיועד GFP. (B) כחול זה לאות דאפי. (ג) חופפים תמונות של ה-GFP, דאפי, DIC. כל התמונות נלקחים יכולת הגדלה X 400 מתחת. סרגל קנה מידה = 50 μm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57914/supplemental_figure.pdf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans at JoVE.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

9.5K Views.  Borough of Manhattan Community College/CUNY. פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

Video: Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

Genetics

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscience

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Immunology and Infection

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...