Name: preparations and protocols for whole cell patch clamp recording of xenopus laevis tectal neurons
Uploaded: 2018-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons at JoVE.com

נתמך על ידי המענק-NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת ויומינג. כל ההליכים, כולל הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, מתבצעות בטמפרטורת החדר, כ 23 ° C. כל השיטות המתוארות כאן ממוטבים עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15).
1. הכנה in Vivo
<ol><li>עזים ומתנגד את הראשן.<ol>
<li>מקם את הראשן בצלוחית קטנה המכילה הפתרון של שטיינברג עם 0.01% MS-222 במשך כ 5 דקות. הערה: MS-222 aka "Tricaine" הוא דגים, דו-חיים הרדמה נפוץ. הראשנים מגודלים בפתרון של שטיינברג במ מ: 0.067 אשלגן כלורי, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES.</li>
		<li>ודא הראשן עמוקות מרדימים (לא מגיב ולא שחייה) לפני שתמשיך לשלב 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אבטח את ראשן anesthetized על בלוק המשוקע סיליקון על הרצפה של המנה לנתח/הקלטה.<ol>
<li>השתמש פיפטה של העברה חד פעמיות כדי לעבור הראשן anaesthetized תבשיל דיסקציה/הקלטה שיש פתרון הקלטה חיצוני (115 מ מ של NaCl, 2 מ מ של אשלגן כלורי, 3 מ מ של CaCl2, 3 מ מ של MgCl2, 5 מ"מ של HEPES, 1 מ מ גלוקוז; להתאים את ה-pH באמצעות 7.25 10 N של NaOH, mOsm osmolarity 255).<ol>
<li>כדי למזער את השריר ספונטנית מפרכס, להוסיף חוסם קולטן של אצטילכולין, tubocurarine (100 מיקרומטר) לפתרון חיצוני. (בדרך כלל, הדבר נעשה באמצעות פיפטה µL 200 להוסיף 100 µL מניה tubocurarine 10 מ מ 10 מ"ל של פתרון חיצוני).</li>
		</ol>
</li>
		<li>באמצעות סיכות חרקים, אבטח את ראשן, בצידו הגבי, לבלוק המשוקע סיליקון אלסטומר (כגון Sylgard 184, ראה טבלה חומרים לפרטים), אשר היה דבוק הרצפה מאכל ויבתר. הערה: המיקום של הפינים הוא קריטי: למקם אותם משני צידי המוח, מספיק סימטרית כדי להימנע משפדים האקסונים מהרשות לשיקום האסיר מביא הפרויקט מהעין ו להזין את המוח רק והשתרשה עמוק בלבה tectum אופטיים (איור 1א').</li>
	</ol>
</li>
	<li>פילה המוח לאורך הקו האמצעי.<ol>
<li>תצוגה ברורה של המוח, להסיר את העור המכסים את המוח על ידי ביצוע חתך שטחי לאורך הקו האמצעי באמצעות מחט סטרילית 25-G.</li>
		<li>פילה המוח לאורך קו האמצע באותו הציר על ידי החדרת המחט לתוך הצינור העצבי ומושך בעדינות כלפי מעלה (dorsally) כגון החלק הגבי של הצינור נקיה שנחתך (קטועה) תוך השארת הצלחת קומה שלמה (איור 1B). הערה: חשוב במשטח הרצפה של הצינור העצבי להישאר שלם כי הקלט החושי מביא להזין את tectum באמצעות לוח קומה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את הקרום חדרית שקוף שמכסה את הנוירונים tectal.<ol>
<li>להעביר את המנה הקלטת התכנית אלקטרופיזיולוגיה ולהשתמש טיפ פיפטה זכוכית שבורה להסרת קרום חדרית המכסים את הגופות התא של נוירון tectal. שבור את הקצה על-ידי גרירתו בקלילות על פני קידמית המשימה העדינה.</li>
		<li>להבריג את פיפטה המחזיק פיפטה, להוריד אותו למטה tectum סיב אופטי דרך micromanipulator.</li>
		<li>השתמש את פיפטה שבור לקלף קרום חדרית הרחק tectum. הערה: אין צורך להסיר את הקרום tectum כולו; חלון קטן יספיק ומספקים גישה שפע של נוירונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשיג כל התא הקלטות מלחציים תיקון. הערה: הגישה מרגע זה והלאה היא דומה בביצוע כל התא תיקון קלאמפ הקלטות מ פרוסות המוח העכבר כפי שמתואר שגב, et al. 16 (איור 1C).</li>
	<li>שיא התגובות נוירון tectal כל השדה הבזק של אור מוקרנת הרשתית.<ol>
<li>להקרין כל השדה הבזק של אור על הרשתית, מקום של סיבים אופטיים סמוך לעין של הראשן. בקצה השני של סיבים אופטיים הוא LED בקנה אחד עם הנגד המשתנה המאפשר בוהק האור להיות נשלט. מפעילים את ה-LED, פלט דיגיטלי של המגבר. בדרך זו, כל השדה הבזקי משתנות בין עוצמות האור יכול להיות מוקלט (איור 4א).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. כל המוח הכנה
<ol><li>בצע שלבים 1.1-1.3. הערה: יש צורך tubocurarine בפתרון חיצוני עבור הכנת.</li>
	<li>לבודד את המוח.<ol>
<li>שימוש במחט 25-G לנתק את hindbrain (איור 2א).</li>
		<li>כדי לבודד את כל המוח של הראשן, בעדינות להפעיל את המחט מתחת המוח, כיוון סימטרית-על-rostral לנתק את כל רקמת חיבור לרוחב ו הגחון של סיבי עצב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאבטח למוח בלוק של אלסטומר סיליקון.<ol>
<li>שוחרר לחלוטין, לאחר לאבטח למוח בלוק של אלסטומר סיליקון על-ידי הצבת סיכה אחת דרך אחת הנורות הריח וסיכה עוד דרך hindbrain (איור 2B). זוהי התצורה האופטימלית עבור הקלטה של נוירונים tectal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את המנה הכוללת הכנת מוצמדים כל המוח מהטווח ויבתר התכנית אלקטרופיזיולוגיה. הסר את הקרום חדרית באמצעות פיפטה זכוכית שבורה כפי שמתואר בשלב 1.4.</li>
	<li>במקום של הפרעה דו קוטבית אלקטרודה מגרה על הצנטר (איפה האקסון נרחבים מכל עין קרוס-המוח האמצעי) ישירות להפעיל את האקסונים מהרשות לשיקום האסיר.<ol>
<li>המקום האלקטרודה גירוי דו קוטבית rostral, ובצמוד כמעט, החדר האמצעי גדול. תצלובת ממוקם מיד rostral את החדר האמצעי גדול (איור 2B).<ol>
<li>בעדינות נמוך יותר האלקטרודה מגרה על גבי הצנטר כך שקע קטן נוצר בתוך הרקמה. האלקטרודה דו קוטבית מונעת על ידי ממריץ את הדופק אשר מאפשר את עוצמת גירוי בדיוק להיות תחת פיקוח.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביצוע ההקלטה מלחציים תיקון התא כולו (איור 2C) כפי שתואר על ידי שגב, et al. 16
</li>
</ol>3. אופקי המוח פרוסה הכנה
<ol><li>בצע שלבים 2.1 ל 2.3.</li>
	<li>השתמש סכין גילוח לסלק הרביעי הכי לרוחב (אילו ויוו המתאים ביותר הגבי הרביעי) של צד אחד של אחד tectum סיב אופטי. החתך הזה מתבצע במקביל למישור rostral-סימטרית כפי שמוצג באיור 3א.</li>
	<li>מחדש להצמיד את המוח לצד אלסטומר סיליקון עם פרוס צד פונה כלפי מעלה (כך somata ואת מורכב ניתן לגשת ישירות עבור הקלטה) והמשטח חדרית של המוח פונה לרחוב elastomer סיליקון (איור 3 B) (כך אלקטרודה דו-קוטבי יכול להיות ממוקם על הצנטר).</li>
	<li>לבצע את כל התא תיקון קלאמפ או המקומי הגישו הקלטה פוטנציאליים (איור 3C) כפי שתואר על ידי שגב, et al. 16
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Order+in+Human+Neurological+Disorder+Using+a+Tadpole.">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li><li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit.">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole.">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit.">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li><li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity.">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351 (2015).</li><li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo.">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li><li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cline+H.T.+of+a+central+glutamatergic+synapse.">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li><li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism.">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li><li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development.">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum.">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horizontal+brain+slice+preparation:+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum.">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).</li><li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure.">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li><li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles.">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li><li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+to+see:+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function.">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles.">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כל השיטות המתוארות בעבודה זו אופטימיזציה עבור הקלטה הנוירונים tectal של ראשנים בין שלב התפתחותי 42, 49 (מבוים על פי Neiuwkoop, פאבר15). ובבמה 42, הראשנים הם גדול מספיק ולא מספיק מפותח כך ניתן למקם את הסיכות חרקים משני צידי המוח להקלטות ויוו , שבצעתי את הקרע כל המוח. בשלבים מוקדמים יותר, כאשר הראשנים הם בעצם דו מימדי (קרי, שטוח), הגישות המתוארים כאן אינם מיטביים.
בשל הקלות שבה הנוירונים tectal ניתן לגשת להקליט ולצפות בתצורת התא כולו, היה מעגל זה מודל חממה על תגליות בסיסיות על טופס מעגלים עצביים איך תוך כדי תפקוד - ותפקוד תוך יצירת19. כאן תארנו כיצד לרכוש כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal, כולל כיצד לבצע את ראשן ויוו כל המוח ההכנות, תצורות שונים הקלטה לבין דוגמאות של סוגים שונים של נתונים. הרשימה הבאה היא דיון היתרונות והמגבלות של כל הכנה, ואחריו טיפים להשגת הקלטות באיכות גבוהה כל התא.
צפרדע רפואית ראשנים להתחיל הצגת התנהגויות הימנעות חזותי לפי שלב 47/48, כ 7-8 ימים לאחר ההפריה3,13. משמעות הדבר היא כי אפילו בשלבים אלה מוקדם יחסית של התפתחות, המעגל retinotectal היא מתפקדת ובעל יכולת של עיבוד גירויים חזותיים. שאלות בסיסיות לגבי פיתוח ו פלסטיות של מעגל retinotectal לבואינו ישירות באמצעות הכנת ויוו להקליט נוירון tectal תגובות לגירויים חזותיים מוקרנת הרשתית. In vivo הקלטות ב הראשן הם פשוטה יחסית לעומת תצורת הקלטה המקביל אצל יונקים בשל הפשטות היחסית במערכת העצבים, חוסר גולגולת. מכיוון נוירון הפרט tectal somas יכולים להיות מטמיעים ויוו, איטום על גבי נוירון מסוים ולהשיג כל התא תיקון קלאמפ הקלטה התצורה היא זהה ל ביצוע מלחציים תיקון התא כולו הקלטה בפרוסה מכרסמים ההכנות. ראשנים לשרוד בדרך כלל מספר שעות על האסדה (אשר יכול להיות מוערך בקלות על ידי ניטור את פעימות הלב). מגבלה אחת הטבועה של ראשן ויוו ההכנה היא כי רק נוירונים tectal המתגוררים השכבה סומאטית עמוק של tectum סיב אופטי, השכבה בה נמצא בסמוך לגן באמצע החדר גדול, נגישים עבור הקלטה (איור 1 ). משמעות הדבר היא כי נוירונים tectal המתגוררים סומאטית השכבות החיצוניות של tectum היה נחקרו במידה רבה ויוו.
היתרון ניסיוני של הכנת כל המוח הוא זה מבודד את המוח של קולטני חישה היקפיים עיניים, עור, ומבטל כל פעילות חושית מונחה כדין. אמנם כבר לא מסוגל להיות מונע על ידי גירויים חזותיים, תשומות עצב מהרשות לשיקום האסיר שמכוונות את tectum עדיין קיימות בהכנת כל המוח והוא הם יכול להיות מופעל ישירות בצורה מאוד מבוקרת באמצעות הפרעה דו קוטבית מגרה אלקטרודה (FHC) מונחת תצלובת שבו שתי קבוצות של מהרשות לשיקום האסיר האקסון ספינלי להזין את המוח. השימוש הראשון דווח על הכנת כל המוח היה בשנת 1996, במחקר חשוב על ידי וו. et al. 8, ב אקסונים מהרשות לשיקום האסיר אשר הופעלו באמצעות אלקטרודה גירוי דו קוטבי כך המחברים יכולים לכמת את כוחו של הפרט אקסונים מהרשות לשיקום האסיר על הנוירונים tectal postsynaptic ובאותו זמן אז גרם תגליות בסיסיות על ההתקדמות של סינפסה ההבשלה. כמו עם ההכנות ויוו , הכנת כל המוח מאפשר גישה רק האלה נוירונים המתגוררים ברובד עמוק, סמוך קרום חדרית.
אמנם tectum סיב אופטי מורכב של 9 תאי הגוף שכבות17, כל מחקרים אלקטרופיזיולוגיה קודמים התמקדו הנוירונים tectal שכבה עמוקה כי המוח כולו המסורתי ואת ויוו ההכנות (המתוארים מעל) לאפשר גישה רק הנוירונים של השכבה העמוקה. כדי לגשת הנוירונים tectal על פני כל השכבות הסומטית, מן העמוקות ביותר כדי השטחית ביותר כמו גם כל מורכב שבו מהרשות לשיקום האסיר אקסונים יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירון tectal דנדריטים, פיתחנו הכנה ששונה כל המוח, המכונה "the המוח אופקי פרוסה הכנה"(איור 314). כמו עם הכנת כל המוח, המוח אופקי פרוסה ההכנה שומרת את האקסונים מהרשות לשיקום האסיר בתוך המוח ולאחר אפשר לשלוט על ידי הנחת של הפרעה דו קוטבית אלקטרודה מגרה על תצלובת.
בסך הכל, ההכנות נועדו כדי למטב את החזיית וגישה אל נוירון tectal somata כדי לבצע את כל התא תיקון קלאמפ הקלטה. ישיר גישה סומא הוא חיוני עבור איכות התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות: גישה הפנימי של הנוירון מחייבת את היווצרות חזק מאוד (> 1 × 109 Ω) לאטום בין פיפטה של קרום פלזמה של הנוירון, המחייב ישירה איש הקשר של קצה פיפטה על גבי קרום זה. ומכאן, מספיקות להסרת קרום חדרית הוא המפתח עבור ההקלטה מוצלחת. גם, מפתח עבור הקלטות עורר מהרשות לשיקום האסיר מוצלח הוא המיקום הנכון של האלקטרודה גירוי דו קוטבית על גבי הצנטר. למעשה כל הנוירונים tectal לקבל קלט סינפטית ישיר האקסונים מהרשות לשיקום האסיר. אם אין תגובה עורר מהרשות לשיקום האסיר נצפית, ואז זה הוא ככל הנראה עקב מיקום שגוי של האלקטרודה דו-קוטבי כזה אינה תקפה הצנטר ואני לא פנייה אל העצבים האופטים. ניתן לתקן על ידי פשוט מיצוב מחדש האלקטרודה מגרה. כשל להתבונן מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובות לאחר מיצוב מחדש האלקטרודה דו-קוטבי, יכול להיות כי התחזית האקסון מהרשות לשיקום האסיר נותק בטעות בזמן. במקרה זה, יש צורך להתחיל מחדש עם תכשיר חדש. לבסוף, כשל להתבונן מענה עורר מהרשות לשיקום האסיר יכול להיות בגלל הקלטות מתא שאינו נוירון tectal נפוצים. למשל, עכשיו, דונלד בדרך כלל אינם מציגים את עורר מהרשות לשיקום האסיר monosynaptic תגובה נורמלית המוצג על-ידי נוירונים tectal, וגם לא הנוירונים mesencephalic גדולות שנמצאו, אם כי במספרים נמוך מאוד, המתגוררים tectum סיב אופטי20. הסבירות של הקלטה של אחד התאים האלה-tectal הוא נמוך מאוד בשל המספר העצום של נוירונים tectal. כמובן, הקלטות באיכות גם לדרוש את הנוירונים tectal כדי להיות בריאים. המאפיינים של נוירון tectal בריאים הם קומפקטי עגול או אובלי מפרחי סומא כי הוא בהיר וללא פגמים. ברגע השיגה תא כל הקלטה תצורה, הבריאות של הנוירון ניתן עוד יותר להעריך ברמת אלקטרופיזיולוגיות על ידי מדידת תכונות חשמליות יסוד כגון נח פוטנציאל ממברנה התנגדות קלט, קיבוליות . פוטנציאל ממברנה מנוחתו של נוירונים tectal בריא בין שלבים התפתחותיים 42 ו 49 הוא כ-45 mV, עם התנגדות קלט הממוצע של GΩ 1 כ ו קיבוליות של 10-12 pF3,4,5. חלק קטן של נוירונים באופן בלתי נמנע יתערער עקב הסרת קרום חדרית. Somata של נוירונים פגום או לא בריא מופיעים מגורענות, נפוח, או עם הזין המצומק. דוגמה נוירון לא בריאה מוצגת באיור 2C. אם הרוב המכריע של נוירונים מופיעים לא בריא, זה יכול להיות השתקפות זה יש משהו לא בסדר עם הפתרון הקלטה חיצוני, אז מומלץ להמציא פתרון הקלטה חיצוני טריים. מלבד מופיעים בריא, הנוירונים הטוב ביותר עבור הקלטת קשורים בדרך כלל עם מספר גדול של נוירונים אחרים, בניגוד להיות מבודדת. כמו כן, לבחור תאים שהם נגישים בקלות. לדוגמה, אל תדחוף את הרקמה קשה מדי לגשת תא כי זה עלול לגרום נזק לרקמת או להזיז את הרקמה ולא ובכך משמרת האלקטרודה מגרה מהמקום. לבסוף, הקלטות צריך להיות מוגבל האמצעי השלישי tectum (איור 2B) כדי להימנע ההבדלים הפוטנציאליים עקב מעבר הצבע התפתחותית שקיים על פני4,rostro-סימטרית ציר8, אלא אם, כמובן, המוקד של הניסוי הוא מעבר הצבע התפתחותית הנ. Tectum המתאים הוא האזור rostral של אזור המקדימות, סימטרית עד לקצה החדר האמצעי גדול סימטרית.
המלחציים תיקון התא כולו הקלטה טכניקה אינה ללא המגבלות. באופן כללי, זה הסגנון של הקלטה כוללת הקלטה נוירון אחד בכל פעם. זאת בניגוד גישות מעורבים הדמיה של דור חדש GCaMP6 סידן אינדיקטורים, המאפשרים הפעילות של אוכלוסיות גדולות של נוירונים לדימות בו-זמנית פרוסה הכנה ו vivo בתוך.
חיסרון נוסף הגלום להקלטות קלאמפ מתח התא כולו הוא השגיאה קלאמפ שטח (חוסר היכולת לשלוט המתח עוד הרבה מעבר סומא), אשר מגביל את השליטה הטמפורלי של מתח4. בסך הכל, נושאים אלה מלחציים מתח הן מינימליות בעת הקלטת של נוירונים tectal עם זאת, בשל גודלו הקטן יחסית שלהם, צנוע arborizations דנדריטים, זרמים קטן ואיטי יחסית בהשוואה בתרבית של נוירונים. מאפיינים אלו של נוירונים tectal לדקלם אותם במיוחד לשכנוע קלאמפ מתח הקלטה, מדידה של פרמטרים רבים ובניית פרופילים עבור נוירונים בודדים5,6.
כיוונים לעתיד כוללים אופטימיזציה של ויוו המוח אופקי פרוסה הכנה כדי לאפיין את הפונקציה של השכבה החיצונית נוירונים בעיבוד של גירויים חזותיים.

המעגל retinotectal הוא המרכיב העיקרי של מערכת הראייה דו-חיים. הוא מורכב RGCs בעיניים, אשר פרויקט אקסונים שלהם כדי tectum אופטיים שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים tectal postsynaptic. המעגל retinotectal ראשן צפרדע רפואית הוא מודל התפתחותי פופולרי ללמוד מעגלים עצביים היווצרות ותפקוד. ישנן תכונות רבות של מעגל retinotectal של ראשן הזה להפוך אותו דגם ניסיוני עוצמה1,2,3. תכונה אחת הגדולות, המוקד של מאמר זה, היא היכולת לבצע את כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal, בתוך vivo או באמצעות הכנה כל המוח. עם מתקן קידוח אלקטרופיזיולוגיה לבוש עם מגבר התומך מתח, זרם-להדק מצבי הקלטה, הקלטות מלחציים תיקון כל התא לאפשר אלקטרופיזיולוגיה של נוירון להיות מאופיין ברזולוציה גבוהה. כתוצאה מכך, התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectal ברחבי השלבים המפתח של היווצרות מעגל retinotectal סיפקו הבנה מפורט ומקיף של ההתפתחות ואת הפלסטיות של מהותי4,5 , 6 , 7 וסינפטית8,9,10,11 נכסים. שילוב כל התא תיקון קלאמפ נוירון tectal הקלטות, היכולת לבטא את הגנים או morpholinos עניין הנוירונים האלה12, שיטה להערכת התנהגות מודרכים חזותי באמצעות בדיקה הימנעות חזותי הוקמה13 מקדמת זיהוי של קישורים בין מולקולות, מעגל פונקציה התנהגות.
חשוב לציין כי הסוג ברזולוציה גבוהה נתונים שנרכשה מן התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות אינה אפשרית באמצעות גישות הדמיה חדשות יותר כמו מחוון סידן גנטית GCaMP6, כי למרות באמצעות מחווני סידן מתירה ההדמיה של סידן dynamics על פני אוכלוסיות גדולות של נוירונים בו זמנית, לא ישיר או דרך ברור כי הפרמטרים חשמלי מסוים יכולה להיות מושגת על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית דלתא, somata, אין שום דרך מתח מלחציים נוירון כדי למדוד זרם-מתח מערכות יחסים. ברור אלה שתי גישות שונות, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה, בעלי עוצמות שאינם חופפים, ליצור סוגים שונים של נתונים. לפיכך, הגישה הטובה ביותר תלויה השאלה ניסיוני ספציפית נותרים ללא מענה.
כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו לרכישת כל התא תיקון קלאמפ הקלטות הנוירונים tectum אופטיים ראשן, שימוש ויוו הכנה, הכנה כל המוח, ושינית וחדש יותר הכנה כל המוח שפותחה במעבדתנו14 . במקטע תוצאות נציג, נדגים את היתרונות ניסיוני של כל הכנה, סוגים שונים של נתונים שניתן להשיג. הגבולות ואת החוזק של תכשירים שונים, כמו גם עצות לפתרון בעיות, כלולים במקטע דיון.

<table><tbody><tr><td>Stemi Stereo 508</td><td>Zeiss</td><td>495009-0006-000&amp;nbsp;</td><td>Dissecting microscope</td></tr><tr><td>MS-222 &quot;Tricane&quot;</td><td>Finquel</td><td>ARF5G</td><td>Amphibian general anesthetic</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124-500G</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Used to prepare Steinberg&#039;s solution</td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-01</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>D-glucose Anhydrous</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>Tubocurarine hydrochloride pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>T2379</td><td>Nicotinic acetylcholine receptor antagonist</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0.1mm diameter stainless steel pins</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>761028</td><td>Preweighed monomer and curing agent kit</td></tr><tr><td>Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4052</td><td>Small petri dishes</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Syringe needles</td></tr><tr><td>1mL Slip Tip Tuberculin Syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Disposable, sterile syringes</td></tr><tr><td>Borosilicate pipette glass</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10HP</td><td>Pulled to desired specifications using pipette pulling machine</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Fabricates micropipettes for electrophysiology recording</td></tr><tr><td>Kimwipes Kimtech wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>Delicate task lint-free wipers</td></tr><tr><td>Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td>Current clamp and voltage clamp headstage</td></tr><tr><td>MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/T</td><td>Control for headstage on electrophysiology rig</td></tr><tr><td>Fiber-Coupled LED (Green)</td><td>Thorlabs</td><td>M530F2</td><td>Fiber optic cable paired with green LED</td></tr><tr><td>Cluster Bipolar Electrode (25&amp;micro;m diameter)</td><td>FHC</td><td>30207</td><td>Bipolar stimulating electrode</td></tr><tr><td>ISO-Flex Stimulator</td><td>A.M.P.I. (Israel)&amp;nbsp;</td><td>Contact manufacturer</td><td>Flexible stimulus isolator</td></tr><tr><td>Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Amplifier for voltage- and current-clamp recording&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1322A digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-135</td><td>Data acquisition system for electrophysiology recording</td></tr><tr><td>Axio Examiner.A1</td><td>Zeiss</td><td>491404-0001-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope for electrophysiology</td></tr><tr><td>Micro-g Lab Table</td><td>TMC</td><td>63-533</td><td>Air table for electrophysiology microscope</td></tr><tr><td>Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit</td><td>Dell</td><td>D06D001</td><td>Computer running electrophysiology software</td></tr><tr><td>c2400 CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>70826-5</td><td>Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging</td></tr><tr><td>7 O&#039;Clock Super Platinum Stainless Razorblades</td><td>Gillette</td><td>CMM01049</td><td>Platinum-coated stainless razor blades</td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Disposable Polyethylene transfer pipets</td></tr></tbody></table>

preparations and protocols for whole cell patch clamp recording of xenopus laevis tectal neurons

המעגל retinotectal של ראשן צפרדע רפואית מורכבת של תאי גנגליון (RGCs) בעיניים איזו תבנית synapses ישירות על גבי נוירונים בריכוזים tectum סיב אופטי, הוא מודל פופולרי ללמוד את המעגלים העצביים איך להתחבר בעצמם. היכולת לבצע כל תא הקלטות מלחציים תיקון הנוירונים tectal ואליהן הרשומה מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובות, גם אין ויוו או באמצעות הכנה כל המוח, יצר גוף גדול של נתונים ברזולוציה גבוהה על המנגנונים שבבסיס נורמלי , חריג, מעגל היווצרות ואת הפונקציה. כאן נתאר כיצד לבצע ויוו ההכנה, הכנת כל המוח המקורי, ופיתח יותר לאחרונה המוח אופקי פרוסה לקראת קבלת התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות של נוירונים tectal. בכל אופן ההכנה יתרונות ייחודיים ניסיוני. הכנת ויוו מאפשר ההקלטה של התגובה הישירה של הנוירונים tectal לגירויים חזותיים מוקרנת העין. הכנת כל המוח מאפשר האקסונים מהרשות לשיקום האסיר להיות מופעל בצורה מאוד מבוקרת, הכנת פרוסה אופקי המוח מאפשר הקלטה של-פני כל שכבות של tectum.

כדי להקליט אור-עורר תגובות כל השדה הבזק של אור מוקרן על הרשתית בזמן התגובה מתועד של נוירונים בודדים tectal (איור 4א). פרוטוקול מסוים זה תוכנן כדי למדוד את התגובה של הנוירון אל האור מגרה ("על" תגובה), ואז ביטול 15 s מאוחר יותר כדי למדוד את "את התגובה." הנוירונים tectal בדרך כלל מוצג חזקים תגובות לסירוגין (מצב קלאמפ שמוצג כאן מתח שהוקלט ב, עם הנוירון כשכרטיס ל- 60mV כדי למדוד זרם סינפטית (איור 4B)). ניתן לכמת את כמות נסיעה סינפטית שהתקבלו על-ידי כל נוירון אחד ע י הקלטת אירועים ספונטניים סינפטית (איור 4C). זרם-מתח מערכות יחסים (עקומות-V) ניתן שנוצר מן הנוירון אותו על ידי צעד הנוירון כדי פוטנציאל יותר ויותר depolarized, הקלטה וכתוצאה מכך מופעל מתח Na+ וזרמים K+ , המכונה "מעורב הנוכחי הקלטות"(איור 4D, E). זה כבר מבוססת היטב כי עבור נוירונים אלה דו-חיים, שיא Na+ ולא ניתן לכמת K+ זרמים דרך הקלטות הנוכחי מעורב כי הפסגות חנותם חופף אחד עם השני4,7.
ישיר הפעלה של אקסונים מהרשות לשיקום האסיר-הצנטר עוקף כל חישוב במעלה ועיבוד של גירויים חזותיים המתרחשים בעיניים, ומאפשר ללמוד את הסינאפסית בין presynaptic מהרשות לשיקום האסיר אקסונים postsynaptic tectal נוירונים ב שלה הטופס הכי טהור, מופחתת. נוירון tectal התגובות הפעלה מהרשות לשיקום האסיר מופקים מן RGCs מגורה על ידי האור או ישירות באמצעות אלקטרודה מגרה דו-קוטבי המורכב משני רכיבים: רכיב monosynaptic (ישיר סינפטית קלט מהמשתמש RGCs מופעל) ו- polysynaptic רכיב (רשת מקומית חוזרים ונשנים פעילות ההזנה חזרה אל מוקלטת הנוירון). במקרה של התגובות עורר אור, הרכיבים monosynaptic, polysynaptic חופפים אחד עם השני על ידי כמה כמות undeterminable. חפיפה טמפורלית הזה מגביל מה ניתן להסיק שמקדם על הסינאפסית בין הרשתית tectum סיב אופטי. באמצעות הכנה כל המוח והפעלת מערכת האקסון מהרשות לשיקום האסיר ישירות באמצעות אלקטרודה מונחת תצלובת (איור 5א), לעומת זאת, מייצרת מונו - רכיב polysynaptic כי הם בעיקרו של דבר שאינם חופפים בזמן. יכול להיות מותאם הכוח מגרה של האלקטרודה הפרעה דו קוטבית. כפי כוחו מגרה הוא גדל, יש מספר רב יותר של אקסונים מהרשות לשיקום האסיר מופעל (איור 5B). פרוטוקול גירוי מינימלי קובע את עוצמת סינפטית האקסון מהרשות לשיקום האסיר בודדים אל נוירון הפרט tectal; פרוטוקול גירוי מקסימאלית משקף את הסכום הכולל, או הקלט המרבית, סינפטית של כל מהרשות לשיקום האסיר האקסונים משולב (איור 5C). היחס הנכון של סינאפסות כדי מעכבות קלט סינפטית (E: אני יחס) שהתקבלו על-ידי הפרט נוירון tectal הוא קריטי עבור הפונקציה חזותי רגילה18. איור 5 D מראה דוגמה מהרשות לשיקום האסיר-עורר סינאפסות הנוכחי עקבות הקליט מ נוירון הפרט tectal. ההסתברות של שחרור המשדר מסופי האקסון presynaptic מהרשות לשיקום האסיר נמדד על ידי הקלטות לזווג את הדופק. בשביל זה, נוירון tectal postsynaptic נרשם במצב קלאמפ מתח כדי למדוד זרמים סינפטית, ואילו האקסונים מהרשות לשיקום האסיר מופעלים במרוכז, מופרדים על-ידי מרווח זמן 50 מילישניות (איור 5E).
התא כולו תיקון קלאמפ הקלטות יכול להתבצע בין הנוירונים tectal המתגוררים בכל שכבה סומאטית. בדומה ההכנה כל המוח, אקסונים מהרשות לשיקום האסיר ' יכול להיות מופעל על ידי הנחת אלקטרודה הקלטה דו קוטבי על תצלובת (איור 6א). כל ההקלטות ביצעו בהכנת כל המוח ניתן גם לבצע שימוש בתכשיר פרוסה המוח אופקי. איור 6 B מראה של בדוגמת מעקב מתגובה עורר מהרשות לשיקום האסיר הקליטה של נוירון בשכבה השטחית. ההכנה הזאת מאפשרת גם עבור התבנית המרחבי של קלט סינפטית מהרשות לשיקום האסיר על גבי דנדריטים tectal שברצונך למדוד. בשביל זה, עורר מהרשות לשיקום האסיר שדה פוטנציאל נרשמים כל 10 מיקרומטר לאורך הציר רוחבי המדיאלי (קרי, הציר דיסטלי-proximal) של מורכב (איור 6C). זה יוצר פרופיל ברזולוציה גבוהה של דפוס קלט מהרשות לשיקום האסיר פונקציונלי. הפוטנציאליות השדה ואז ניתן להפוך צפיפויות המקור הנוכחי על-ידי חישוב נגזרות המרחבי14 השני, הצפיפויות המקור הנוכחי בתורו יכול להיהפך מגרש התמונה. העלילה התמונה איור 6ג מציג הקלט מהרשות לשיקום האסיר החזק ביותר מטרות האזור דיסטלי יותר מורכב.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig1.jpg"> איור 1. אין ויוו הכנת נהלים. (א) ראשן ריתקה על פיסת סיליקון elastomer. סיכות מסומנים באמצעות החצים הלבנים. הערה מיקום הסיכה יותר סימטרית כדי להימנע משפדים את ספינלי אופטיים. הקו המקווקו לבן מציין את קו האמצע. (B) Zoomed בתצוגה של כל המוח לאחר חיתוך לאורך הקו האמצעי הגבי והסרה בשכבת-על העור. (ג) כל תא תיקון-קלאמפ הקלטה ויוו. (L: לרוחב. מ: רכיסה המדיאלי. R: rostral. C: סימטרית. D: הגבי. V: הגחוני /. אוב: הריח הנורה. OT: Tectum סיב אופטי. HB: Hindbrain). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57465/57465fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig2.jpg"> איור 2 . כל המוח הכנת נהלים. (א) לאחר המוח הוא מטיגון לאורך הקו האמצעי, hindbrain לוקה בחסר. (B) כל המוח גזור החוצה, להצמיד את elastomer סיליקון. הכוכבית לבן מציין את ה-pin של הנורה הריח השמאלי. התיבה האדומה מציינת השלישי האמצעית של tectum, כלומר, אזור היעד עבור הקלטה. (ג) כל התא תיקון קלאמפ הקלטה באמצעות הכנה כל המוח. הכוכבית השחורה מציינת את האזור של האו ם שרוטים קרום חדרית שבו תאים לא ניתן לגשת להקלטה. שבו הקרום הוסרה בהצלחה, somata מופיעים יותר ברור ומוגדר. החץ מצביע של נוירון לא בריא. (PZ: אזור המקדימות. LMV: החדר האמצעי גדול. אוב: הריח הנורה. OT: Tectum סיב אופטי. HB: Hindbrain. L: לרוחב. מ: רכיסה המדיאלי. R: rostral. C: סימטרית. D: הגבי. V: הגחוני /). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57465/57465fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig3.jpg"> איור 3 . המוח אופקי פרוסה הכנת נהלים. (א) בחלק הלטראלי ביותר של צד אחד של tectum סיב אופטי נפרס (שצוין על-ידי הקו המקווקו) לאחר הכנה כל המוח. (B) המוח אופקי פרוסה הכנה לאחר ריתקה לצד אלסטומר סיליקון. קווים לבנים זוגי מייצגים אלקטרודה מגרה מונחת הצנטר. (ג) Zoomed בנוף של סומא שכבות מורכב באמצעות הכנה פרוסה המוח אופקי. עקומת מקווקו מציינת את הגבול בין סומא שכבות מורכב. איור זה שונה מחן, et al. 14 (l: לרוחב. מ: רכיסה המדיאלי. R: rostral. C: סימטרית. D: הגבי. V: הגחוני /. אוב: הריח הנורה. OC: האופטי. OT: Tectum סיב אופטי. HB: Hindbrain). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57465/57465fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig4.jpg"> איור 4 . הקלטות הכנה ויוו . (א) מפרטים טכניים מציג את התצורה טיפוסי של הקלטת ויוו . אור (B) עורר תגובות כולל אור על ואור את התגובות. שיבוץ עקבות הם שהתצוגה ב- view של - ואת חופש-תגובה, בהתאמה. זרמים postsynaptic סינאפסות ספונטנית (ג) נרשמה. (ד) Na+ וזרמים K+ בתגובה מתח תהדק את השלבים מ-60 mV 30 mV של נוירון בודד. (E) IV חלקות המופקים עקבות ב (ד). כל ההקלטות נעשו עם נוירון שנערך ב-60 mV חוץ ב (ד) כדי ליצור הרביעי-מגרשים; הנוירונים הם ניגש פוטנציאל יותר ויותר יותר depolarized, ב- 10 דרגות mV, להפעלת זרמים תלויי-מתח. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57465/57465fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig5.jpg"> איור 5 . הקלטות הכנה כל המוח. (א) מפרטים טכניים מציג תצורת טיפוסי של הקלטת כל המוח כולל של אלקטרודה מגרה מונחת הצנטר (ירוק ואדום קווים מייצגים מהרשות לשיקום האסיר אקסונים). Overlaying (B) עקבות של ההיענויות מהרשות לשיקום האסיר על שינויים של כוח גירוי מהרשות לשיקום האסיר. (ג) מקסימום גירוי תגובה (משמאל) והתגובה גירוי מינימלי (מימין). (ד) מהרשות לשיקום האסיר-עורר תגובה סינאפסות אל נוירון בודד. (E) מדגמים מזווגים דופק ההנחיה של תגובת עורר מהרשות לשיקום האסיר נוירון הפרט. (אבוב: הריח הנורה. OC: האופטי. OT: Tectum סיב אופטי). כל ההקלטות נעשו עם נוירון שנערך ב-60 mV חוץ (D) כדי למדוד את הקלט סינאפסות: הקלט סינאפסות נרשם על-ידי החזקת הנוירון כמה פוטנציאל ההיפוך של γ-אמינו בוטירית (GABA)-מתווכת כלוריד זרמים (-45 mv); הקלט המעכבת על-ידי החזקת הנוירון כמה פוטנציאל ההיפוך של חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא)-מתווכת זרמים (+5 mv). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57465/57465fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57465/57465fig6.jpg"> איור 6 . הקלטות מוח אופקי לחתוך הכנה- (א) מפרטים טכניים מציג את התצורה של הכנה פרוסה המוח אופקי. שימו לב כי למרות האלקטרודה מגרה נשאר הצנטר, פיפטה הקלטת עכשיו ממוקם לתאים גישה לרוחב כל השכבות tectal נחשף על ידי הכנה פרוסה המוח אופקי. (B) מענה מהרשות לשיקום האסיר של נוירון המתגוררים השכבה השטחית של tectum. (ג) נרשם שדה פוטנציאל ברחבי מורכב את המומר הנוכחי מקור הצפיפויות (CSDs) המוצג על ידי מפות חום מגרש תמונה. (OC: האופטי. OT: Tectum סיב אופטי. HB: Hindbrain). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57465/57465fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons at JoVE.com

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

preparations-protocols-for-whole-cell-patch-clamp-recording-xenopus

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

9.4K Views.  University of Wyoming. בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

Video: Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Biology

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Developmental Biology

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

יצירת תצורת תא שלם באמצעות שיטת Patch Clamp

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Slice ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: A Method to Study Electrical Properties of Neurons

Source: Roy, B., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/50551/" target="_blank">Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells</a>. J. Vis. Exp. (2013).
This protocol describes a technique called whole-cell patch clamp electrophysiology, which is a method to study electrical properties of Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

Source: Roy, B., et al. Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells. J. Vis. Exp. (2013).
This protocol describes a technique called ...

Danio rerio (zebrafish)

Embryo

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

Source: Tu, H., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54608">Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. External and Internal Solutions

	...

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

יצירת תצורת תא שלם באמצעות שיטת Patch Clamp

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

רישום מהדק טלאי של תא שלם בנוירון ג'לטינוזה מהותי של פרוסת חוט השדרה

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

יצירת תצורת תא שלם באמצעות שיטת Patch Clamp

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

רישום מהדק טלאי של תא שלם בנוירון ג'לטינוזה מהותי של פרוסת חוט השדרה

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus