פרסום זה נתמך על ידי מענק של משרד החינוך (PR פרס # 17-P031C160025, כותרת פרוייקט: 84.031 C) לקהילות קולורדו סטייט-פואבלו (CSU-Pueblo) כדי לבנות גזע פעיל האירוסין (C-בסיס). אנו מודים זואולוגיה הנוכחי ופרסמה Elsevier למתן זכות שימוש בו את התוצאות נציג עבודות קודמות, כמו גם העורכים של יופיטר סיפק לנו ההזדמנות לפרסם פרוטוקול זה. כן נרצה להודות C-בסיס התוכנית, ד ר בריאן סטאש מציע (C-בסיס, המחלקה לביולוגיה, CSU-Pueblo), הפקולטה לביולוגיה CSU-פואבלו, תומאס דה גרציאנו Graziano ד ר ברנרד Possidente (המחלקה לביולוגיה, סקידמור המכללה), ד ר קלייר וריאן ראמוס (החוג לביולוגיה, אוניברסיטת מדינת קולורדו-Pueblo) על תמיכתם סיוע.

המחברים אין לחשוף.

דרוזופילה melanogaster הוקם כמודל עוצמה עבור מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים עקב השימור נרחב של גנים מסלולים בין13, melanogaster ד . ובני14. מאותן סיבות שזה מודל רב עוצמה עבור מדע הרפואה, דרוזופילה התפתחה מערכת מודל מתאים לחקור את ההשפעה של זיהום אנתרופוגניים על מגוון של נקודות קצה רעילות. מספר מעבדות בהצלחה משתמש melanogaster ד כמערכת מודל ללמוד מגוון של חומרים, כולל מתכות כבדות11,16,18–25,37 ,38,39,40,44,45, אתנול46, חלקיקים26,47, הדברה48 , ו ממיסים49. למרות המאמצים האחרונים כדי לנצל דרוזופילה כמודל רעלים, את השימוש בו כמערכת מודל לענות על השאלות רעילות אינספור הוא עדיין בחיתוליו. אולם, בהתחשב שלה שימוש נרחב כמודל עבור נקודות קצה הקשורות מבחינה רפואית, כמו גם השימוש בו באופן אקולוגי50 ו לימודי האבולוציה17, הפוטנציאל כמערכת מודל רעילות הוא עצום.
כאן, אנו מציגים שיטות לגידול מינים שונים בתוך הסוג דרוזופילה באמצעי מזוהמים לבדיקת רעילות נקודות קצה שונים. אמנם צורות אחרות של חשיפה אפשרית באמצעות דרוזופילה כמודל (למשל שאיפת וחשיפה עורי), פרוטוקול זה מתמקד צריכת אוראלי מזהמים אשר יש צורך מזהמים זה יהיה באופן טבעי (בלע כמו דרך שרשרת המזון). שיטות אלה יכולים להכיל את השימוש מספר מינים דרוזופילה וכן מזהמים. אוכלוסיות פרא, גנטית משתנה של דרוזופילה יכול גם להיות שנאספו בשטח ומתוחזק במעבדות מחקר. ישנן אפשרויות רבות של מלכודות, פיתיונות שניתן להשתמש בהם, תלוי בהעדפות המזון מינים; עבור שדה מדריכים על אוסף שדה, עיין Markow ואו'גרידי33 ורנר, Jaenike34. בנוסף, השיטות אפשר לשנות, כדי לקבוע את ההשפעה של חשיפה התפתחותית בתקופות שונות התפתחותית קריטי ומאפשר בדיקה multigenerational לטווח ארוך של חשיפה מזהם.
השלבים הקריטיים של שיטות אלו כוללים: (1) שמירה על טוס מניות בתנאים שבשליטת לסביבה, (2) הימנעות צפיפות היתר של אוכלוסיות זבוב, (3) דילול החומר מבחן על פי התכונות הכימיות שלו ובחירת (4) ריכוזי החומר מבחן רלוונטי מבחינה ביולוגית. שמירה על מניות חממות מוסדר לסביבה (או חדר קטן) מבטיחה כי וריאציות נוספות ותנאי הסביבה לא וחיסול תוצאות. בנוסף, שינויים עונתיים בהתנהגות בעבר נמצאו51 והזן מספר מינים דרוזופילה תרדמה ואסטרטגיה מעל החורף52. שנית, זחל צפיפות יתר יכול להיות השלכות ארוכות טווח על פיתוח30הגוף למבוגרים גודל30, אריכות ימים53. בנוסף, דילול של החומר הוא צעד חיוני כדי להבטיח כי הזיהום זמין ביולוגית עבור דרוזופילה לצבור את הזיהום. לדוגמה, PbAc התפרקה ב dH2O23,24,25, ואילו כימיקלים אחרים ייתכן שיהיה צורך להיות מומס במים מלוחים או אתנול. בחירת רלוונטי מבחינה ביולוגית ריכוזי הזיהום יכול להשפיע על הכיוון של התוצאות; לדוגמה, במינון נמוך של PbAc להגדיל את הנקבות מספר רשע להזדווג עם הזכרים (במרחק של 20 דקות), ואילו מינונים גבוהים יותר להראות יתקצר משמעותית במספר אכזרי של נקבות להזדווגות19. כדי לזהות ריכוזי החומר מבחן רלוונטי מבחינה ביולוגית, הקוראים לשקול הפעלת מחקרים ראשוניים כדי לקבוע את מינון קטלני ואת LD50 כדי לקבוע במינונים המתאימים לבצע עקומת מנה-תגובה. על ידי ביצוע עיקול מנה-תגובה כדי לבדוק את טווח ריכוזים על נקודת קצה של מסוים, הקוראים יכולים לאתר מינונים שהם "מועילים" או "מסוכנים" ליחידים או אוכלוסיות לבדיקה נוספת.
פרוטוקול זה מספק שדרה כדי לקבוע: 1) הגומלין של רמות מרובות הביולוגי של הארגון כושר ונקודות קצה רעילות; 2) את התפקיד של גורמים התפתחותיים מתהווים; 3) נקודות קצה מבחינה אקולוגית-חשוב; 4) חשוב מבחינה רפואית-נקודות הקצה; 5) מספר איך לחצים אינטראקציה לייצר תוצאות; ו- 6) ההשפעה של חשיפה ארוכת טווח שעולה דורות. כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה, ראיות סופק המציין כי אנשים שנחשפו במהלך פיתוח לצבור Pb (טבלה 1)23,24. בנוסף, נציג התוצאות מראות כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את ההשלכות של חשיפה על נקודות קצה אקולוגי-חשוב (למשל., ההשפעה של חשיפה התפתחותית Pb ב- mate הבחירה24). בנוסף, אחרים צריך לבדוק את ההשפעות של מזהמים על מספר רמות ביולוגיות של הארגון (כולל פיזיולוגיים18,21,22 ו פנוטיפי-רמות גנטי20,19 , 23 , 24 , 25), הקצה חשוב מבחינה רפואית18,20,21,22,23, ו לטווח ארוך תופעות multigenerational23,24 25, ,54. בנוסף, נתונים ראשוני עולה כי חשיפה Pb התפתחותית המניע transgenerational השפעות epigenetic על פוריות ב melanogaster ד54. הגבלה חשובה של פרוטוקול זה הוא השימוש של פרוטוקול זה עם דרוזופילה הוא בחיתוליו. לכן, ישנם פרסומים מוגבל18,19,20,21,22,23,24,25 לכתובת הפוטנציאל של הפרוטוקול לענות על שאלות רעילות נוספים, כגון התפקיד של פיתוח, גורמים מתהווה, הקצה אקולוגי-חשוב נוסף, מספר לחצים השלכות אבולוציונית של חשיפה.
באמצעות פרוטוקול זה, הקוראים תוכל לבדוק מזהמים כי באופן טבעי בלע בשיטות רלוונטי מבחינה ביולוגית. האכלה נוזלי רציפה, שפותחה על ידי סוארש ואח. 55 היא גישה חלופית עבור בליעה דרך הפה, במיוחד עבור ההדברה. האכלה נוזלי רציפה זאת, מתאים למבוגרים בליעה של מזהמים נוזלי וישימים לא מזהמים שבו יחידים עשויים להיות חשופים וגיחתו מראש. זה חשוב במיוחד בהתחשב הפוטנציאל עבור תקופות קריטיות בהתפתחות לחשיפה. מחקרים קודמים הראו תקופה קריטית עבור Pb חשיפה23. לכן, דרוזופילה צריך להיחשף במהלך פיתוח כדי למנוע חיסול פעיל פוטנציאלי של מזהמים על-ידי דרוזופילה לפני בדיקות עד תקופות קריטיות יכול להיקבע.
לסיכום, סיפקנו פרוטוקול לחשוף אורלית דרוזופילה מזהמים. בעזרת המערכת פרוטוקול ומודל toxicologists ניתן לשוות לקראת גישות מוסריות לא פולשנית לניסויים בבעלי חיים ובאבטחה בו זמנית בצורה הוליסטית להבנת השפעת מזהמים8.

בכל שנה, כ- 1,000 כימיקלים חדשים מוצגים על-ידי1,התעשייה הכימית2; עם זאת, ההשפעות הסביבתית של רק אחוז קטן של כימיקלים אלה נבדקים לפני הפצה2,3. אסונות בקנה מידה גדול אמנם נדיר, חשיפה לא קטלני וכרוני מגוון רחב של מזהמים מתאפיינות בני אדם והן חיות הבר4,5. המוקד ההיסטורית של ecotoxicology, טוקסיקולוגיה סביבתית היה לבחון את הקטלניות, החשיפה כימי יחיד, חשיפה אקוטית, את ההשפעות הפיזיולוגיות של חשיפה, כאמצעי למדידת ההשפעה של מזהמים על הישרדות6, 7 , 8 , 9 , 10. למרות שיש שינוי לעבר גישות מוסריות לא פולשנית לניסויים בבעלי חיים, לגישות הם הגבלת בגלל התפקיד הזה פיתוח נכסים מתהווים, גורמים חיצוניים (כגון האוכלוסייה ברמת ו רמת המערכת האקולוגית אינטראקציות) לשחק תיווכה נקודות קצה אקולוגי-חשוב8. לכן, אין צורך בשיטות המשלבות בגישה הוליסטית יותר מבלי להתפשר על חיות הבר ו/או בעלי חוליות במעבדה.
מערכות מודל הגעה, כגון דרוזופילה melanogaster, הם אלטרנטיבה אטרקטיבית לענות על הצורך בגישה הוליסטית יותר בדיקות רעילות. ד melanogaster, פותחה במקור כמערכת מודל הגעה עבור האדם הקשורות מחקר גנטי לפני כמאה11. ד melanogaster עכשיו באופן בולט משמש כתחליף דגם חוליות מכמה סיבות: 1) שימור גנים מסלולים בין melanogaster ד ובני; 2) זמן דור קצר בהשוואה מודלים חוליות; 3) עלות זולה תחזוקה; 4) להקל על מנת לייצר גדלי מדגם גדולים; ו- 5) שפע של נקודות קצה פנוטיפי ו אקולוגי-רלוונטיות זמינות לבדיקה11,12,13,14,15,16,17 .
מספר מעבדות11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 . עכשיו משתמש melanogaster ד כתחליף דגם חוליות לבדיקת רעילות כדי להבין את ההשפעות של זיהום על בני אדם. מיני בר מקומיים דרוזופילה יכול להיות מנוצל, כמו גם, כמודלים רעילות עבור חיות הבר (ובני האדם) לענות באופן אקולוגי-, התנהגותית-, שאלות רלוונטיות אבולוציונית ברמות מרובות הביולוגי של הארגון. באמצעות מינים בתוך הסוג דרוזופילה כמודל, מספר נקודות הקצה למדידה הם אפשריים11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. . In addition, באמצעות מודל דרוזופילה , יכול toxicologists: 1) מבחינה מוסרית לקשר אפקטים ברמות מרובות הביולוגי של הארגון; 2) לשלב את התפקיד של הגורמים מתהווים והתפתחות; 3) מחקר אקולוגי-חשוב נקודות הקצה (בנוסף חשוב מבחינה רפואית הקצה); 4) בדיקת לחצים מרובים בו זמנית. 5) ומבחן ארוך טווח multigenerational (למשל אבולוציוני ו transgenerational) ההשלכות של לחצים. לכן, השימוש דרוזופילה כמערכת מודל מאפשר מספר רב של גישות, לא רק ללמוד גישות מכניסטית עם המפגרים זני melanogaster ד במעבדה.
בנייר זה, אנו מציגים את השיטות לגידול ואיסוף דרוזופילה לענות על שאלות שונות רעילות. ליתר דיוק, אנו מתארים את המתודולוגיה 1) לגידול דרוזופילה בינוני עם אחד או יותר מזהמים; 2) איסוף את דרוזופילה במהלך פיתוח (למשל נודדים הזחלים השלישי-לחלל, המקרים הגולמי, ומבוגרים לאחרונה eclosed מבוגרים); ו 3) לגידול דרוזופילה במדיום מזוהמים מבחן דורי שידור transgenerational, כמו גם השלכות אבולוציונית של חשיפה toxicant לטווח ארוך. שימוש זה פרוטוקול, הקודם מחברים18,19,20,21,22,23,24,25 דיווחו אפקטים פיזיולוגיים גנטיים, התנהגותיים שונים של התפתחותית עופרת (Pb2 +) חשיפה. פרוטוקול זה מאפשר toxicologists להשתמש בגישה הוליסטית יותר רעילות, שהיא הכרחית להבנת כמה מזהמים הם גורמי סיכון הן בני אדם וחיות בסביבה מזוהם אי פעם יותר ויותר.

<table><tbody><tr><td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td><td>Carolina Biological</td><td>173204</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-116SB</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td><td>Genessee Scientific</td><td>49-102</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, trays only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-124</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-126</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-312D</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-409-17C</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-287-150</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-683-708</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-114</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Flystuff foot valve</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-121</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-124G</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td><td>VWR</td><td>97064-130</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td><td>Walmart</td><td>Not applicable</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inbred or wildtype line of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center at Indiana University</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu</td></tr><tr><td>Wild popultions of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>UC San Diego &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center</td><td></td><td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

נכסים מתהווים וגורמים חיצוניים (האוכלוסייה וברמת ברמת המערכת האקולוגית אינטראקציות, בפרט) משחק תפקידים חשובים במתווכים הקצה חשוב מבחינה אקולוגית, למרות שהם נחשבים לעתים נדירות מחקרים רעילות. ד melanogaster מתגלה כמודל הרעלים עבור התנהגותית נוירולוגית, גנטי ההשפעות של חשיפה לרעלים, שם כמה. חשוב מכך, מינים של הסוג דרוזופילה יכול להיות מנוצל כמו מערכת מודל לגישה אינטגרטיבית מסגרת לשלב נכסים מתהווים ולענות על שאלות רלוונטיות מבחינה אקולוגית במחקר הרעלים. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול חשיפת מינים של הסוג דרוזופילה לחומרים מזהמים כדי לשמש כמערכת מודל עבור מגוון של פלטים פנוטיפי, שאלות רלוונטיות מבחינה אקולוגית. ליתר דיוק, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי 1) לקשר מספר רמות ביולוגיות של ארגון ולהבין את ההשפעה של חשיפה לרעלים על שני הפרט ואת האוכלוסייה-ברמת הכושר; 2) לבחון את ההשפעה של חשיפה לרעלים בשלבים שונים של חשיפה התפתחותי; 3) לבדוק את ההשלכות multigenerational ואבולוציוני של מזהמים; . ו-4) בדיקת לחצים וגורם לניתוקו מרובים בו-זמנית.

מאת אורלית שחשף דרוזופילה contaminant(s) במהלך פיתוח, שאלות רעילות שונים יכול להיבדק על ידי חשיפת דרוזופילה ברמות שונות של הארגון הביולוגי. סעיף זה מציג נציג התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה מאמרים שפורסמו בעבר23,24. בפרט, פרוטוקול זה שימש בעבר כדי להעריך את הצטברות, חיסול ואת פחמיות של עופרת (Pb) בתוך הדור באותה חשיפה ועל -פני הדור הראשון של הצאצאים23; ללמוד את ההשלכה של הצטברות על חבר הבחירה24.
טבלה 1 ו- 4 איור הצג תוצאות נציג שהושג באמצעות פרוטוקול זה כדי לקבוע את הצטברות ואת חיסול של Pb ב F0 והן F1 דורות.
טבלה 1 מציגה את התוצאות נציג מעידה על ההצטברות של Pb כאשר הם נחשפים תוך דור (במינונים שונים: 0 10, 40, 50, 75, 100, 250, 500 מיקרומטר PbAc) הדגימות שנבדקו בשלבים התפתחותיים מרובים (נודדים הזחלים השלישי-לחלל, המקרים הגולמי, שזה עתה eclosed מבוגרים, ואני בוגר נקבות וזכרים) בפיטרסון ואח. 23 דגימות נאספו בשלבים התפתחותיים שונים, קפוא ב-20 ° C, מטופלים עם חומצה חנקתית, מימן על-חמצני, ונבדק Pb באמצעות ICP-MS23,42.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מינון (PbAc מיקרומטר)</td>
			<td style="text-align: center;">זחל</td>
			<td style="text-align: center;">המקרים הגולמי</td>
			<td style="text-align: center;">לאחרונה Eclosed מבוגרים</td>
			<td style="text-align: center;">נשים בוגרות בוגרות</td>
			<td style="text-align: center;">הזכרים הבוגרים בוגרת</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td style="text-align: center;">0.009 ± 0.001</td>
			<td style="text-align: center;">0.099 ± 0.02</td>
			<td style="text-align: center;">0.04 ± 0.005</td>
			<td style="text-align: center;">0.069 ± 0.031</td>
			<td style="text-align: center;">0.0015 ± 0.003</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td style="text-align: center;">0.42 ± 0.025</td>
			<td style="text-align: center;">0.46 ± 0.03</td>
			<td style="text-align: center;">0.12 ± 0.009</td>
			<td style="text-align: center;">0.12 ± 0.012</td>
			<td style="text-align: center;">0.056 ± 0.008</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td style="text-align: center;">7.5 ± 0.67</td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td style="text-align: center;">5.2 ± 0.71</td>
			<td style="text-align: center;">2.77 ± 0.30</td>
			<td style="text-align: center;">1.11 ± 0.14</td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
		</tr>
<tr>
<td>75</td>
			<td style="text-align: center;">14 ± 1.06</td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td style="text-align: center;">12 ± 0.95</td>
			<td style="text-align: center;">4.7 ± 0.38</td>
			<td style="text-align: center;">3.36 ± 0.58</td>
			<td style="text-align: center;">1.20 ± 0.63</td>
			<td style="text-align: center;">1.24 ± 0.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>250</td>
			<td style="text-align: center;">89 ± 8.49</td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;">25.06 ± 4.72</td>
			<td style="text-align: center;">5.46 ± 0.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>500</td>
			<td style="text-align: center;">271 ± 41.01</td>
			<td style="text-align: center;">334.30 ± 39.43</td>
			<td style="text-align: center;">8.44 ± 0.84</td>
			<td style="text-align: center;">46.50 ± 14.72</td>
			<td style="text-align: center;">14.43 ± 1.83</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: אומר המון Pb (ng/הפרט) במקצועות Melanogaster ד במהלך הפיתוח לאחר חשיפה אוראלי Pb משלב הביצה כדי לבדוק את הבמה. אמצעים (ng/טוס) ± לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע המוצגת (n = 8 זחל, n = 3 גדלו שליטה מבוגרים, n = 3 מבוגרים גדלו-Pb). פראי סוג melanogaster ד שמשקל בפקד או עופרת בינוני (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 או 500 מיקרומטר PbAc) משלב הביצה ועד בשלבים שונים של פיתוח. דוגמאות היו נאספים ונבדק הצטברות Pb באמצעות ICP-גב'42 שטבלה זו שונתה מ פיטרסון ואח. 23
איור 4, הדור הורים (F0) נחשף Pb מכל שלבי הביצה לבגרות, הזדווגו אמצעי שליטה, ואת הדור הראשון של הצאצאים (F1) שמשקל שליטה בינונית עד לבגרות24. שיטות לזיהוי Pb הצטברות ולמניעת היו הדומה פיטרסון ואח. 23. תוצאות הניסוי הזה מציינים כי חשיפה הורים לא מועבר הדור הראשון של צאצאים בוגרים24. לכן, משתמש פרוטוקול זה, אפשרי לבחון תגובות מסתגלת סולמות אבולוציוניים שונים, כמו גם תופעות transgenerational של F0 חשיפה. תוצאות דומות נמצאו פיטרסון ואח. 23
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig4.jpg"> איור 4: ההצטברות Pb Melanogaster ד (א) הורים (F0) ו- (ב) סמויה הצאצאים (F1). ברים (א) ו- (ב) מראים ממוצע (ng/מבוגר) ±SEM. גודל מדגם המוצג לעיל ברים (א) ו- (B). = p < 0.001. (א) F0 מבוגרים נחשפו אורלית מיקרומטר 250 PbAc באמצעות פרוטוקול זה משלב הביצה עד גיל 5 d פוסט-וגיחתו ומאופקים גיל 6 ימים שלאחר וגיחתו (לאחר 24 שעות depuration) כדי לבדוק אם הצטברות Pb באמצעות ICP-גב'42(B) F0 מבוגרים היו הזדווגו בתוך טיפול בקרה בינוני. שלא נחשפו F1 הצאצאים היו מופשטים ומנותחים בינוני בקרה משלב הביצה עד לבגרות (באמצעות פרוטוקול זה) ובדק עבור הצטברות Pb באמצעות ICP-MS. ב (B): "CF + ס"מ"= F1 מבוגרים עם ההורים גדלו אמצעי שליטה,"CF + PbM"= F1 מבוגרים עם האבות מופשטים ומנותחים בינוני לדלק נטול עופרת,"PbF + ס מ"= F1 מבוגרים עם האמהות מופשטים ומנותחים בינוני לדלק נטול עופרת,"PbF + PbM"= F1 מבוגרים עם ההורים מופשטים ומנותחים בינוני לדלק נטול עופרת. דמות זו שונתה מ פיטרסון. et al. 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
התוצאות שהוצגו טבלה 1 ו- 4 איור מציינים כי דרוזופילה מצטברת בקלות Pb-מינונים שונים, בשלבים התפתחותיים, סולמות אבולוציוניים תוך שימוש בפרוטוקול זה. לכן, הדבר מעיד על היעילות של הפרוטוקול לחשוף melanogaster ד מזהם בעל פה.
איור 5, הפרוטוקול המתואר כאן היה בשימוש על ידי פיטרסון. et al. 24 כדי לבחון את ההשפעה של חשיפה Pb התפתחותית על חבר העדפה. נושאים ניסיוני שמשקל משלב הביצה עד לבגרות בפקד או עופרת בינונית משלב הביצה עד לבגרות ונבדק על העדפה חבר לאחר 24 שעות של depuration. פיטרסון ואח. 24 מצא כי נשים חשופות-Pb מעדיפים הזדווגה עם זכרים החשופים Pb כאשר ניתנת האפשרות של שליטה או הזכר חשוף Pb. תוצאות אלה הן נציג דוגמה ליישום פרוטוקול לבחון את הפלט פנוטיפי.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig5.jpg"> איור 5: חבר להעדיף זכרים ונקבות חשופות מיקרומטר 250 – שלב PbAc מביצה לבגרות- ברים (א), (B), ו- (ג) להציג אחוז רשע (%) ההזדווגות ± הצלחה (60 דקות) ב- SEM. * * * = p < 0.001. * = p < 0.05. נושאים ניסיוני ב (א), (ב) ו- (ג) נחשפו לפקד או עופרת בינוני (מיקרומטר 250 PbAc) מן הביצה שלבים לבגרות בשלה ונבדק ההבדלים בבחירת חבר. (א) נקבה העדפה או זכרים גדלו שליטה או חמאת בוטנים (כלומר שני-בחירה מבחן). גודל מדגם היו: N = 126 נקבות גדלו שליטה ונקבות גדלו-Pb 137. (B) העדפה זכרים לנקבות שליטה - ו Pb-גדלו (כלומר שני-בחירה מבחן). היו גדלים דוגמאות: N = 59 גדלו שליטה זכרים ו- N = 64 גדלו-Pb זכרים. (ג) חבר להעדיף הן הזכרים והן הנקבות כאשר ביחידים יחד עם שותף אחד או חשיפה (קרי לא-הבחירה בדיקות). ב (ג): "CF + ס מ" = אחד גדלו שליטה נשית לזווג עם זכר אחד גדלו-בקרה (N = 85 זוגות), "CF + PbM" = אחד גדלו שליטה נשית לזווג עם זכר אחד גדלו-Pb (N = 79 זוגות), "PbF + ס מ" = אחד נקבה Pb-גדלו יחד עם זכר אחד גדלו שליטה (N = 91 זוגות), "PbF + PbM"= נקבה אחת גדלו-Pb + זכר אחד גדלו-Pb (N = 98 זוגות). דמות זו שונתה מ פיטרסון. et al. 24. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory at JoVE.com

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

בנייר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חשיפת מינים של הסוג דרוזופילה לחומרים מזהמים עם המטרה של הלומדים את ההשפעה של חשיפה על מגוון של תפוקות פנוטיפי בשלבים התפתחותיים שונים, יותר מאשר דור אחד.

נסיוני באמצעות דרוזופילה כמערכת מודל הגעה לבדיקת רעילות במעבדה

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

experimental-protocol-for-using-drosophila-as-an-invertebrate-model

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

12.6K Views.  Colorado State University-Pueblo. בנייר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חשיפת מינים של הסוג דרוזופילה לחומרים מזהמים עם המטרה של הלומדים את ההשפעה של חשיפה על מגוון של תפוקות פנוטיפי בשלבים התפתחותיים שונים, יותר מאשר דור אחד.

Video: Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Neuroscience

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Developmental Biology

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Assay העדפות טעם למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent years. However, studies that elucidate the underlying mechanisms for ZnO NP-induced toxicity are scanty. We determined the toxicity profiles of ZnO NPs using both in vitro and in vivo experimental models. A significant decrease in cell viability was observed in ZnO NP-exposed MRC5 lung fibroblasts, showing that ZnO NPs exert cytotoxic effects. Similarly, interestingly, gut exposed to ZnO NPs exhibited a dramatic increase in reactive oxygen species levels (ROS) in the fruit fly Drosophila. More in-depth studies are required to establish a risk assessment for the increased usage of ZnO NPs by consumers.

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

We describe a detailed protocol for evaluating the toxicological profiles of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) in particular, the type of cell death in human MRC5 lung fibroblasts and ROS formation in the fruit fly Drosophila.

מחקר רעילות של תחמוצת אבץ חלקיקים בתרבות התא ו- Drosophila ילה מלאנוסטר

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Immunology and Infection

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

מודל פציעה דרוזופילה In Vivo ללמוד Neuroregeneration ב ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicine

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

יישום אקטואלי Bioassay כדי לכמת רעילות קוטל חרקים עבור יתושים וזבובי פירות

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

הערכת רעילות כימית במלנוגסטר דרוזופילה למבוגרים

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...

Lifespan Protocol for Drosophila melanogaster: Generating Survival Curves to Identify Differences in Fly Longevity

Source: Bovier, T. F., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/59535/" target="_blank">Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
Scientists use the Drosophila lifespan protocol to measure how different experimental conditions affect flies&#39; longevity and generate survival curves in the process to quantify the experimental outcomes. The sample protocol features the assay being applied to study the effects on longevity from exposure to varying concentrations of endocrine disruptor chemicals, or EDCs, such as 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2).

פרוטוקול תוחלת חיים עבור Drosophila melanogaster: יצירת עקומות הישרדות לזיהוי הבדלים בתוחלת החיים של זבובים

Source: Bovier, T. F., et al. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
Scientists use the Drosophila lifespan ...