Name: extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה ד ר רוברט Heinzen על מתן מניות של ביטוי mCherry Coxiella burnetii. אנו מודים ד ר לואיס טיישיירה על מתן וירוס ססגוני הגעה 6 מרכז מניות בלומינגטון מתן מניות לעוף. פרויקט זה מומן בחלקו על ידי NIH מענק R00 AI106963 (A.G.G.) ואת אוניברסיטת מדינת וושינגטון.

1. זיהום ex-vivo
<ol><li>בינוני וציוד<ol>
<li>תחת תנאים סטריליים, להכין טרי דרוזופילה Hemocyte בידוד בינוני (DHIM) הכוללת של 75% שניידר דרוזופילה בינוני עם 25% סרום שור עוברית (FBS) ומסנן לחטא זה.</li>
		<li>שכבה 2-3 חתיכות של 10 ס"מ על 10 ס"מ הסרט פרפין תחת stereomicroscope.</li>
		<li>הכינו את נימי זכוכית. הגדר את החימום פולר נימי 55% לכל היותר. משוך את צינור קפילרי כדי ליצור קצה חד של-10 מיקרומטר.</li>
		<li>מילוי נימי עם שמן מינרלי.</li>
		<li>להרכיב צינור קפילרי מלא על גבי nanoinjector (איור 1א') ופתח צינור קפילרי מאוחה עצה על ידי שבירת את קצהו עם מלקחיים (איור 1B). הקוטר החיצוני של הטיפ צריך להיות 100 מיקרומטר עבור ספיגת קל של hemocytes.</li>
		<li>להוציא כמה שיותר שמן ככל האפשר מקצה צינור קפילרי ולאחר מכן למלא את DHIM. להמחשת קל של הגבול של hemolymph למעלה, אני מסודר, והשמן, כוללים בועת אוויר בין שמן DHIM (איור 1ב'').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph החילוץ<ol>
<li>לבחור 3rd instar דרוזופילה הזחלים מבפנים קיר של מזון שבקבוקי בעדינות באמצעות מלקחיים, למקם אותם לתוך מסננת 100 מיקרומטר (איור 1C). 3rd לחלל הזחלים מצויים 3-6 ימים בעקבות הביצה פוריה הנחת על ידי אישה מבוגרת. הערה: ניסויים אלה להשתמש את גנוטיפ, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, מאחר hemocytes של החיות האלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) כדי לסייע בזיהוי של התאים על-ידי מיקרוסקופיה משופרות.</li>
		<li>שופכים 5 מ ל מים סטריליים הזחלים ולנער את מסננת על המקום ס' 5 מסננת על פעילות מחיקה להסיר את עודפי המים (איור 1ג').</li>
		<li>להעביר את הזחלים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. עזים ומתנגד אותם עם גז CO2 5 s (איור 1D).</li>
		<li>מניחים את הזחלים על גבי הסרט פרפין תחת stereomicroscope, בצד הגבי פונה כלפי מעלה (איור 2א).</li>
		<li>מקום הזכוכית נימי בקלילות אל הגוף האחורי זחל שיצמיד אותו למקום בו לשבש את הקוטיקולה אחורי פתח באמצעות מלקחיים המחודד בסדר (איור 2B).</li>
		<li>אפשר את hemolymph לזרום אל הסרט פרפין (איור 2C).</li>
		<li>להכין מאגר של hemolymph כולל hemocytes מ- 20-50 הזחלים בכל פעם על הסרט פרפין.</li>
		<li>תופסים hemolymph במאגר באמצעות הזכוכית נימי-nanoinjector (איור 2D). הערה: צריך להיות בערך 10-20 µL של hemolymph.</li>
		<li>הוצא את hemolymph לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל 500 µL של DHIM (איור 2E).</li>
		<li>חזור על שלבים 1.2.4) - 1.2.9) על כל הזחלים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לספור את מספר hemocytes.<ol>
<li>פיפטה 5 µL של 0.4% פתרון Trypan blue בצינור microcentrifuge 0.6 מ"ל כדי להכתים את התאים המתים. בעדינות לערבב את DHIM ואת hemocytes בצינור 1.5 mL באמצעות פיפטה, ולא להעביר 5 µL של DHIM כולל hemocytes אל הצינור microcentrifuge 0.6 מ"ל ומערבבים בעדינות.</li>
		<li>פיפטה 10 µL של תאים מ- 1:1 Trypan blue: hemocyte התערובת לתוך hemocytometer.</li>
		<li>לספור את מספר hemocytes בשידור חי זה לא מוכתמים Trypan כחול כל אחד מהשדות בפינה של hemocytomter ולחשב את ריכוז hemocytes למיליליטר באמצעות הנוסחה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> כאשר X הוא הריכוז של hemocytes חיה למיליליטר; a, b, c ו- d הם מספר תאים חיים (כפי שנקבע על ידי הדרה Trypan blue) כל 4 של השדות במניין את hemocytometer. חילוק ב 2 המספר הכולל של תאים נספרים הוא דילול 1:1 של התאים עם Trypan blue. תאים מוכתם Trypan blue נחשב מת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex-vivo זיהומים<ol>
<li>לקבוע מספר בארות כדי להיות נזרע עם תאים בהתבסס על timepoints, ביולוגיים משכפל לצורך ניסוי. 5.0 × 104 hemocytes הם רצויים לטיהור RNA וחלבון בעקבות זיהום.</li>
		<li>לחשב את עוצמת הקול של פתוגן מניות כדי לדלל אותו עם DHIM זיהום באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> איפה ריבוי של זיהום (MOI) הוא המספר של נגיפי או חיידקים הרצוי בכל תא. הערה: MOI בשימוש תלוי בניסוי בודדים ואת מבחני שבוצעה. . הנה, הגנום 10 מקבילות (GE) / תא burnetii ג, 10 CFU/תא ליסטריהאו 150TCID /cell של IIV6 היה בשימוש.</li>
		<li>להכין µL 500 של פתוגן בינוני כל טוב של צלחת 24-טוב על-ידי הוספת נפח מתאים של DHIM לאמצעי האחסון נגיפי או חיידקי בשפופרת.</li>
		<li>המקום 12 מ מ עגול כיסוי זכוכית (מס ' 1 עובי) בטוב של צלחת 24-. טוב.</li>
		<li>לפצל את DHIM כולל את hemocytes לתוך בארות של צלחת 24-. טוב.</li>
		<li>להוסיף 500 µL של פתוגן בינוני hemocytes בטוב.</li>
		<li>Centrifuge את הצלחת ב 1,000 x g למשך 5 דקות.</li>
		<li>דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 28 מעלות צלזיוס. כל 15 דקות, להטות בעדינות את הצלחת בחזרה קבלה, ואז משמאל לימין עבור 5 s ביד.</li>
		<li>לאחר האחד עשר של הפלישה/מצורף צעד 1.4.8), בעדינות פיפטה את המדיום הפתוגן לשטוף את hemocytes עם DHIM טריים ו למלא אותו עם 500 µL של DHIM טריים.</li>
		<li>תקופת דגירה של hemocytes נגוע של הזמן המבוקש. בניסויים אלה, burnetii ג- או נגועה IIV6 hemocytes מודגרת למשך 24 שעות, ליסטריה-hemocytes נגוע מודגרת למשך 1, 2 או 4 שעות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. זיהום in vivo
<ol><li>זיהום<ol>
<li>חמים צלחת אגר דרוזופילה מיץ פירות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לוחות עשויים כאמור תיאר20.<ol>
<li>להוסיף 30 גרם של אגר 700 מ"ל של מים ושל אוטוקלב זה למשך 40 דקות.</li>
			<li>להמיס 0.5 גר' מתיל paraben ב- 10 מ"ל אתנול מוחלטת.</li>
			<li>הוסף את הפתרון paraben מתיל 300 מ ל תרכיז מיץ פירות.</li>
			<li>במהירות לערבב להתרכז מיץ בתוך תמיסת אגר בלוק, לוותר על 5 מ ל 10 × 35 מ מ פטרי.</li>
			<li>לאחר הצלחות קיררה למשך 15 דקות, לאחסן אותם ב 4 º C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין 3rd לחלל הזחלים ביצוע השלבים 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>מניחים את העיסה שמרים על צלחת אגר. לעשות חתך בסדר בצלחת אגר איפה הזחלים ניתן להעביר כדי למנוע ייבוש (איור 3א). להרכיב מחט טונגסטן המחודד מ מ 0.001 עם מחזיק מלקחיים באמצעות סרט פרפין (איור 3B, C).</li>
		<li>פיפטה 50 µL של mCherry גבוהה-כייל לביטוי -burnetii ג (5.95 × 109 ג ' נרל אלקטריק/mL) על גבי הפרפין סרט תחת המיקרוסקופ סטריאו ולמקם את הזחלים לתוך הבריכה של חיידקים.</li>
		<li>מקם את הזחלים לתוך הבריכה של חיידקים. . שמוק הזחלים עם מחט טונגסטן (איור 3ד') להעביר את הזחלים על גבי צלחת אגר (איור 3E).</li>
		<li>להעביר את המדיום הפתוגן הנותרים על צלחת אגר, לאטום את הצלחת עם סרט פרפין.</li>
		<li>להשאיר את הזחלים בצלחת באוויר לח עד הזיהום שלאחר הזמן הרצויים (איור 3F). בניסוי זה, burnetii ג-נגועים הזחלים הם על הצלחת במשך 24 שעות ביממה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph החילוץ, ציפוי של hemocytes<ol>
<li>להכין את בינוני ציוד בעקבות צעד 1.1).</li>
		<li>המקום 12 מ מ עגול כיסוי זכוכית (מס ' 1 עובי) בטוב של צלחת 24-. טוב. פיפטה 500 µL של DHIM לתוך הבאר.</li>
		<li>לחלץ את hemolymph של הזחלים נגוע ביצוע השלבים 1.2.4) - 1.2.8).</li>
		<li>הוצא את hemolymph לתוך גם בעקבות צעד 2.2.2).</li>
		<li>חזור על 2.2.3) ו 2.2.4) עבור קבוצות מרובות של הזחלים.</li>
		<li>Centrifuge את הצלחת ב 1,000 x g למשך 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>תיקון ולא מכתים<ol>
<li>לאחר ומאפשר את hemocytes להתיישב על הזכוכית המכסה העגול בתוך הבאר, להסיר בעדינות את המדיום מכל קידוח.</li>
		<li>בעדינות להוסיף 200 µL של 4% paraformaldehyde (PFA) כל טוב של hemocytes התיישבו. דגירה של hemocytes עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להסיר את % 4 מחברים ולהוסיף בעדינות µL 200 ל- PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 ו- 1% אלבומין שור (BSA) כל טוב. דגירה של hemocytes 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להסיר את PBS ולהוסיף בעדינות µL 200 של 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי מכל קידוח. דגירה של hemocytes 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר את הפתרון דאפי ולהוסיף בעדינות PBS מכל קידוח. דגירה של hemocytes עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>ירידה 10 µL של המדיום antifade גובר על משטח זכוכית מיקרוסקופ.</li>
		<li>לאחר הסרת מגניב מכל קידוח, הסר הזכוכית המכסה הצלחת 24-ובכן באמצעות מלקחיים הארכית פיין. הנח בעדינות את הזכוכית המכסה על המדיום הרכבה antifade בשקופית זכוכית, עם hemocytes פונה כלפי מטה.</li>
		<li>לאפשר את השקופית להתייבש על-ידי הצבתו של הלילה האפל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה קונפוקלי<ol>
<li>קביעת התצורה של מיקרוסקופ קונפוקלי להדמיית צבע שלוש של דאפי, EGFP ו- mCherry. השתמש בהגדרה הבאה: עירור דאפי (לשעבר) 405 ננומטר, פליטה (em) 415-480 ננומטר; EGFP לשעבר 488 ננומטר, em 493-564 ננומטר; mCherry לשעבר 587 ננומטר, em 597-700 nm.</li>
		<li>למקם את הדגימה על המיקרוסקופ, דגש על המדגם באמצעות 63 X / 1.4 מטרת מפתח נומרי (NA). אתר hemocytes הרצוי בתחום התצוגה עבור הדמיה.</li>
		<li>להתאים את רווחי כוח, גלאי לייזר על מנת להשיג חשיפה המתאימה של המדגם. בדוק z-מישורים מרובים כדי להבטיח שרמת החשיפה מתאים העובי המדגם כולו.</li>
		<li>לאתר את המיקום העליון והתחתון על ציר z של hemocyte כולו. הגדר תפקידים אלה מיקומי ההתחלה והסיום עבור z-חלוקתה.</li>
		<li>השתמש רק זום סריקה תמונת אזור הכולל את hemocyte. זום גורמים של 3 X משמשים לעתים קרובות.</li>
		<li>לאסוף את סדרת תמונות ברזולוציה המתאימה כגון 1024 x 1024 פיקסלים במישור x-y, ומרווח 0.3 מיקרומטר בממד z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שחזור דגם תלת-ממד הערה: תוכנת קוד פתוח קיימת המבצעת מהפונקציות המתוארים להלן עבור שחזור דגם התלת-ממד.<ol>
<li>לייבא קובץ סדרת z-למחלקה התמונה לתוך התוכנה המשויכים מיקרוסקופ קונפוקלי עבור שחזור דגם התלת-ממד.</li>
		<li>בחר בתא מציג שיתוף לוקליזציה של גרעינים צבעונית עם דאפי, mCherry הבעת burnetii ג ב EGFP לבטא hemocyte. לחתוך את הסידרה התמונה כדי להכיל רק התא הבודד.</li>
		<li>בחר באפשרות הצופה 3D, אשר משחזר את דגם התלת-ממד באמצעות אלגוריתם ארוזים מראש של התוכנה. בחר בסוג הרצוי של ייצוג תלת-ממד בין תערובת, משטח ואפשרויות מעורבת. בשיטה זו, hemocytes, גרעינים, ג burnetii מוצגים באמצעות מודלים השטח.</li>
		<li>להתבונן התא המשוחזרת 3D מזוויות צפייה שונות על-ידי החזקת לחצן העכבר וגרירת הסמן סביב המסך. התאם את הכיוון התא ואת המיקום של מקור האור מעוצבת כדי למטב את התמונה. קיימות גם אפשרויות אחרות עבור אטימות, מינימום הסף המרבי, Specular, אמביינט, Shineness ואת גמא כדי למטב את התמונה.</li>
		<li>קח חתכים דרך המודל באמצעות מסיכה ואופטים כדי להמחיש את תכולת hemocyte הפנים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. יישום לניתוח ג'ין ו/או חלבון
<ol><li>בעקבות הזיהום עם IIV6, ליסטריה, lyse תאים עבור לרביעיית עוקבות-PCR או ניתוח תספיג תיאר כאמור21 והוראות היצרן הבא. הערה: עיין טבלה של חומרים עבור צבעי יסוד לרביעיית-PCR והנוגדנים עבור תספיג חלבון.</li>
	<li>לנתח PCR מוצרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל agarose, כפי שתואר לעיל22, כדי להבטיח אורך תקין של המוצר מוגבר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+of+Drosophila.">The immune response of Drosophila.</a> Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).</li><li>Regan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+signaling+is+essential+to+regulate+innate+immune+cells+and+fight+bacterial+infection+in+Drosophila.">Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).</li><li>Yano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+control+of+listeria+through+intracellular+innate+immune+recognition+in+Drosophila.">Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila.</a> Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).</li><li>Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Bacterial+Factors+Control+Susceptibility+of+Drosophila+melanogaster+to+Coxiella+burnetii+Infection.">Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection.</a> Infect Immun. 85 (7), (2017).</li><li>Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+hemocyte+load+is+associated+with+increased+resistance+against+parasitoids+in+Drosophila+suzukii,+a+relative+of+D.+melanogaster.">High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster.</a> PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).</li><li>Tsuzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+between+humoral+and+cellular+immune+responses+in+Drosophila.+is+guided+by+the+cytokine+GBP.">Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP.</a> Nat Commun. 5, 4628 (2014).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Drosophila.+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens.">Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).</li><li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+Drosophila+immunity.">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li><li>Arefin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+Hemocytes+Induces+a+Shift+in+Effector+Mechanisms+in+the+Drosophila.+Immune+System+and+Leads+to+a+Pro-Inflammatory+State.">Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State.</a> PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).</li><li>Rus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Filamin-240+in+Drosophila+blood+cells.">Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells.</a> Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemese,+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein,+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila.">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).</li><li>Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicing+of+viral+replication+intermediates+during+silencing+of+latent+Drosophila+viruses.">Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).</li><li>Jovel, J., Schneemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Drosophila+cells+persistently+infected+with+Flock+House+virus.">Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus.</a> Virology. 419 (1), 43-53 (2011).</li><li>Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+extracting+hemocytes+from+wild+caterpillars.">A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars.</a> J Vis Exp. (69), e4173 (2012).</li><li>Sampson, C. J., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+ex+vivo+incubation+of+Drosophila+primary+post-embryonic+haemocytes+for+real-time+analyses.">Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses.</a> Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster.">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+fruit+juice+egg+plates.">Drosophila fruit juice egg plates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).</li><li>Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+Iridescent+Virus+6,+a+DNA+Virus,+Stimulates+a+Mammalian+Innate+Immune+Response+through+RIG-I-Like+Receptors.">Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors.</a> PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva.">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li><li>Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+inverse+Poisson+distribution+to+calculate+multiplicity+of+infection+and+viral+replication+by+a+high-throughput+fluorescent+imaging+system.">Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system.</a> Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).</li><li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellocyte+differentiation+in+Drosophila.+larvae+parasitized+by+Leptopilina.">Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina.</a> Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).</li><li>Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+wounding+is+a+minimal+and+sufficient+trigger+for+a+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).</li><li>Ozgen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+invertebrate+iridovirus.">Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus.</a> Virus Res. 189, 286-292 (2014).</li><li>Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+first+complete+DNA+sequence+of+an+invertebrate+iridovirus:+coding+strategy+of+the+genome+of+Chilo+iridescent+virus.">Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.</a> Virology. 286 (1), 182-196 (2001).</li><li>Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Coxiella+burnetii+parasitophorous+vacuole.">The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole.</a> Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+prophenoloxidases+respond+inconsistently+to+Cu2++and+have+different+activity+in+vitro.">Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro.</a> Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).</li><li>De Gregorio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immune-responsive+Serpin+regulates+the+melanization+cascade+in+Drosophila.">An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila.</a> Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).</li><li>Kari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+raspberry+Gene+Is+Involved+in+the+Regulation+of+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single-cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells.">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).</li><li>Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Binding+of+the+Conserved+Transcription+Factor+Grainy+Head+to+its+Target+Genes+Throughout+Drosophila+melanogaster+Development.">Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development.</a> Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).</li><li>Yang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomes+of+lineage-specific+Drosophila+neuroblasts+profiled+by+genetic+targeting+and+robotic+sorting.">Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting.</a> Development. 143 (3), 411-421 (2016).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Immune+Circuits+by+Linking+CRISPR-Pooled+Screens+with+Single-Cell+RNA-Seq.">Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.</a> Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).</li><li>Karaiskos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+embryo+at+single-cell+transcriptome+resolution.">The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.</a> Science. 358 (6360), 194-199 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כדי להבין טוב יותר איך נדבקים התאים המארחים, חשוב להבהיר הלוקליזציה של פתוגן בתאים, במיוחד כאשר ערך ניסויים על הפתוגן נבדק בעבר ותא סוג שילובים4. בעוד לומד את המפל תגובת תאי בעקבות זיהום יכול להצביע על פלישת פתוגן פרודוקטיבי, השילוב של נתוני ההיענות הדמיה וסלולריות חיוני כדי להדגים לפלישה הפתוגן ולדלקת. בעוד דוחות מציג תמונות דו-ממד של פתוגן הפלישה לתוך התאים מארח נוטה להצביע על זיהום פרודוקטיבי, כמה שאלות עשויים להישאר לגבי העיתוי של פלישת פתוגן הראשונית בתוך התאים המארחים. לפיכך, דגמי תלת-ממד של z-סעיף סריקה של תמונות דו-ממד ניתן שאלות אלו, לציין מיקום הפתוגן בתאי המארח (איורים 4 ו- 5). אולם, הגבלה של השימוש העיקרי hemocytes הוא תוחלת החיים שלהם בתרבות התא. הדוח הקודם קובע כי הישרדות hemocyte תא תרבות התקשורת היא רק 8 שעות18, בפרוטוקול זיהום שלנו, הצלחנו לבצע מבחני עד 24 שעות, אך לא עוד. לכן, לא ניתן היה לצפות רמות גבוהות של שכפול burnetii ג או היווצרות חלולית parasitophorous אשר אינו מתחיל להיווצר עד 2 ימים לאחר הפגיעה היא לא גדולה שצבע עד 4-6 ימים לאחר הפגיעה30 .
עבור ניסויים רבים שבו מבחני הקצה לנצל חלבונים או RNA לניתוח, מספר גדול של תאים נדרשים בדרך כלל לייצר מספיק חומר החקירה. לדוגמה, כאן, אנו משתמשים הקצה של ניתוחים כגון סופג המערבי ו- PCR לרביעיית כדי לחקור את היקף זיהום הפתוגן ראשי hemocytes נגזר 3rd instar הזחלים דרוזופילה . לכן, השיטה המוצגת כאן מתמקדת לנתיחה זחל מהירה, אוסף hemolymph המכיל מספיק hemocytes בשידור חי נגוע הפתוגן vivo לשעבר . שיטה זו מציגה את השימוש nanoinjector כדי לקחת את hemolymph ואת hemocytes במהירות. הצבת את hemocytes DHIM המכיל 25% FBS חשוב להישרדות hemocyte. בנוסף, עבור ex-vivo הזיהומים המובאת כאן, נדרשים מספר רב של hemocytes. כדי להימנע melanization31,32,33, דיסקציה ואוסף hemocyte חייבת להתבצע במהירות. בעוד שיטות אחרות לחילוץ hemocyte קיימים18,19,23, משך הזמן של שיטות אלה לאסוף מספר גדול מספיק של hemocytes ex-vivo זיהום היה ארוך מדי. הטיפ בסדר 100 מיקרומטר הוא מועיל הקליטה של hemolymph בלי איברים אחרים עשויים להוביל סתימת של המחט נימי. השימוש nanoinjector גם להיות אוטומטי כשהוא צמוד לשלב micromanipulator, רגל הדוושה, המאפשר למשתמש להתמקד חיתוך מהיר של הזחלים דרוזופילה ולהקטין הפעם hemocytes הם ללא סביב זחל מדיה התרבות רקמות או התא. עם זאת, השימוש פיפטה זמין גם לקחת את hemolymph להעברה DHIM. בנוסף, השיטה שלנו מנצל גז2 CO עזים ומתנגד הזחלים לפני ניתוח; השימוש של בלוק קר עם כיסוי הסרט פרפין הוא להשתמש בשיטה אחרת23. לבסוף, דיסקציה של הזחלים בכל טיפת DHIM במהלך שחרורו של hemolymph עשוי להפחית את מספר hemocytes אשר אינם נשמרים מפני לסרט פרפין אך יגדיל את הזמן הנחוץ עבור ספיגת המחט נימי.
החיסון תגובה שכיחה בדרוזופילה פציעה, אשר מתרחשת במהלך הפתיחה, ניתוח הקוטיקולה זחל, הוא melanization31,32,33. במהלך החילוץ של hemocytes, אנחנו תתבונני melanization hemocytes ב DHIM מוקדמת של 10 דקות לאחר החילוץ. כפי melanization הוא תהליך מהיר, תאים אלה תשתף מן הניסויים זיהום הפתוגן. בנוסף, ניתן להוסיף את phenylthiourea אנטי מקריש DHIM כדי לעכב את מערכת הפעלה-phenoloxidase ואת melanization במהלך ופצעו9. בכל זאת, כפי melanization המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות תגובות מערכת החיסון המולדת של דרוזופילהאפופטוזיס, הרמות שלהם יכול להיות כימות החילוץ hemocyte הבאים וגירוי בשיטות המתוארות כאן.
בעת שחזור כמויות גדולות של חלבונים או חומר ה-RNA היא דרישה עבור טכניקות כגון תספיג לרביעיית-PCR, טכניקות חדשות, כגון RNAseq דורשים הרבה פחות קלט חומר, pg 10 קטנה כמו של RNA סך באיכות גבוהה של תא בודד34. ניסויים כגון אלה להעלות מעניין שאלות ניסיוני מאז דרוזופילה hemocytes הם אוכלוסיה הטרוגנית המכילה תאים קריסטל, plasmatocytes, ו lamellocytes7, אחד יכול להתחיל לחקור התגובה תעתיק של כל תא הקלד35. לדוגמה, Kurucz et al., פיתחו נוגדנים שניתן להשתמש בו כדי לבודד דרוזופילה hemocyte קבוצות משנה יכול לשמש תעתיק או פרוטיאומיה מבנית פרופיל בעקבות גירויים שונים. בנוסף, ההתפתחות האחרונה של תא בודד RNAseq טכנולוגיה יכול להגדיר transcriptomes של כל סוג התא ללא השימוש של נוגדנים בתחילה נפרדים לכל תא מסוג36,37,38, 39. יתר על כן, אחד יכול לשאול שאלות הנוגעות הכונה של קבוצות משנה hemocyte עשוי לעזור לנו להבין איך האדם שושלות תא דם שמקורו ולא התפתחו אורגניזמים העתיקה באמצעות גנומיקה השוואתי מאמצים. בהתמודדות עם בעיות כאלה דורשת השילוב של מגוון רחב של טכניקות ניסיוני, בטכניקה המתוארת כאן עשויה להיות שימושית עבור מאמצים כאלה כאשר בידודו של מספר גדול של hemocytes של הזחלים הגעה נדרשת.
כאן, אנו מציעים שהשילוב של תלת-ממד מודלים עם נתונים מספריים, הביוכימי לאישור של זיהום. בעתיד מחקרים, אנו יכולים להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי לבחון תגובות מערכת החיסון ואת המנגנון של פתוגן הפלישה לתוך התאים המארחים על ידי שיתוף מכתים מארח חלבונים לבדיקה מיקרוסקופית.

דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל ומבוססת המחקר של מולדת חסינות1. במהלך התגובה החיסונית מולדת, hemocytes יש תפקיד חשוב בתגובה לאתגר הפתוגן. Hemocytes הם קריטיים עבור לבצע טפילים, כמו גם יש תפקיד חשוב במאבק נגד המחלה דרך פעולה phagocytic במהלך זיהום פטרייתי, ויראלי, חיידקי2,3.
על מנת להבין בצורה הטובה ביותר של המחשב המארח תגובה חיסונית מולדת לזיהום חיידקים פתוגניים, חשוב להמחיש איך הפתוגן חודר התאים המארחים במהלך זיהום. הדמיה זו תורמת להבנת המנגנון של פלישה. יחד עם הפרטים של פתוגן לוקליזציה תאיים ואת התגובה התאית, נתונים אלה יכולים לספק רמזים על התגובה מארח זיהום, את organelles הסלולר שבה אינטראקציה תא החיידק. לפיכך, דגם התלת-ממד שחזור לאחר הדמיה על ידי מיקרוסקופ יכול להיות מועיל לקבוע את המיקום המדויק של פתוגנים בתוך התאים המארחים. במחקר זה, אנו דמיינו את הפלישה Coxiella burnetii (burnetii ג), סוכן סיבתי של קדחת Q, מחלה נגיפית אשר מהווה איום רציני לבריאות האדם ושל בעלי החיים, לתוך ראשי דרוזופילה hemocytes. לאחרונה, הוכח כי דרוזופילה רגישים רמת אבטחה 2 פאזות 9 מייל II (NMII) לשבט 4 מזן burnetii ג ו הזן זה אפשרות לשכפל דרוזופילה4, המציין את דרוזופילה יכול לשמש כאורגניזם מודל ללמוד burnetii ג פתוגנזה.
מחקרים קודמים השתמשו hemocytes כדי לבדוק תגובה חיסונית מולדת של המחשב המארח. Hemocytes שימשו הבחנות מורפולוגיות5,6,7, morphometric ניתוח2,8, phagocytosis ניתוח2,3, לרביעיית-PCR2 , 9, immunoprecipitation10,11, ניתוח immunofluorescent10,12immunostaining13,3,immunoblotting10, 9, 11 ו אימונוהיסטוכימיה14. למרות דרוזופילה S2 תאים זמינים גם עבור ניסויים במבחנה שונים, immortalization, פוטנציאל זיהום ויראלי הקיימת מראש לשנות התנהגות שלהם,15,16. השימוש העיקרי תאים לעומת קו תא מונצחים, כגון תאים S2, מאפשר המחקר של תפקוד מערכת החיסון מולדים במערכת יותר ייצוגית של האורגניזם כולו. בנוסף, הזיהום של hemocytes ויוו, לפני החילוץ, מאפשר את התאים אינטראקציה עם המארח חלבונים אחרים רקמות, יתרון על החילוץ של hemocytes לפני שמחוץ זיהום. כבר מנוצל מספר שיטות שונות להשגת מספר מספיק של hemocytes בתקופה קצרה של זמן לשמור את hemocytes בחיים8,17,18,19.
במחקר זה, אנו מציגים שיטה כדי לחלץ hemocytes דרוזופילה 3rd לחלל הזחלים זיהום חיידקים פתוגניים burnetii ג, ליסטריה (ליסטריה) או חסרי חוליות ססגוני וירוס 6 (IIV6). אנו מתארים את פעולות השירות עבור זיהומים hemocyte הן vivo והן ex-vivo . In vivo- ו - ex-vivo-hemocytes הנגועים היו דמיינו מיקרוסקופיה קונפוקלית, ששימשו לבניית מודלים 3D הפלישה burnetii ג . בנוסף, באמצעות פרוטוקול החילוץ, ex-vivo-hemocytes נגועות שימשו עבור ביטוי גנים וחלבונים מבחני. באופן ספציפי, לבחון את היקף זיהום עם IIV6, ליסטריה, הכולל RNA או חלבון היה מבודד את התאים לרביעיית-PCR או ניתוח תספיג. יחדיו, הפרוטוקול מספקת שיטות לאסוף במהירות מספר גבוה של hemocytes מן 3rd לחלל הזחלים וראיות hemocytes הראשית, נגוע או ויוו או vivo לשעבר, הם פלטפורמה מתאימה עבור חיידקים הפתוגן זיהום מחקרים וניתוחים במורד הזרם הרלוונטיים כגון מיקרוסקופ, transcriptomics פרוטאומיקס.

<table><tbody><tr><td>Schneider&#039;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&amp;nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filter (0.22 &amp;micro;L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Strainer (100 &amp;micro;m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Capillary puller</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;delivery apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Coxiella burnetii&lt;/em&gt; - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; fruit juice plates</td><td>Cold Spring Harbor Protocols</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Methyl paraben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch&#039;s 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Petri dishes, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)</td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Holding forceps</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Antifade mounting medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3D imaging reconstruction software</td><td>Leica</td><td>LASX with 3D visualization module</td><td>3.3)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>strain: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 &amp;micro;g/ml streptomycin at 30 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA degradation</td></tr><tr><td>cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA synthesis</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3&#039;</td></tr><tr><td>IIV6_193R_R</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3&#039;</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_fwd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_rev</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green qRT-PCR reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes antibody</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Actin antibody produced in rabbit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis

במהלך זיהום פתוגניים של דרוזופילה melanogaster, hemocytes יש תפקיד חשוב בתגובה החיסונית לאורך כל הזיהום. לכן, המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח שיטה כדי להמחיש את פלישת פתוגן בתא החיסון הספציפי של זבובים, כלומר hemocytes. באמצעות השיטה המוצגת כאן, עד 3 × 106 hemocytes בשידור חי ניתן להשיג 200 דרוזופילה 3rd לחלל הזחלים 30 דקות לשעבר vivo זיהום. לחלופין, hemocytes יכולים להיות נגועים ויוו באמצעות הזרקה של 3rd לחלל הזחלים ואחריו hemocyte החילוץ עד 24 שעות לאחר הפגיעה. אלו תאים נגועים הראשי היה קבוע, צבעונית, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר מכן, ייצוגים תלת-ממד נוצרו מן התמונות להראות באופן מוחלט לפלישה הפתוגן. בנוסף, ה-RNA באיכות גבוהה עבור לרביעיית-PCR ניתן להשיג איתור של פתוגן mRNA הבאים לזיהום, ולא מספיק חלבון יכול להיות מופק תאים אלה לניתוח תספיג חלבון. יחדיו אנו מציגים שיטה התאמת מובהק של פלישת פתוגן ואישור של זיהום באמצעות סוגי הפתוגן בקטריאליים וויראליים שיטה יעילה לחילוץ hemocyte כדי להשיג מספיק hemocytes בשידור חי של דרוזופילה הזחלים לניסויים זיהום ex-vivo ו ויוו .

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis at JoVE.com

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

11.6K Views.  Washington State University. שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחז?...

Video: Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Developmental Biology

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Biology

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

הערכת היכולת הייחודית ביותר לגיל מיוחד למבוגרים דרוזופילה מלאנוטציטים באמצעות שיטת בVivo פגוציטוזה

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

הפרעה בקוטיקולה: שיטה לאיסוף המולימפה מזחלי דרוזופילה

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (fruit fly)

Larva

Larval Lymph Gland Dissection: Isolating the Drosophila Hemocyte-Producing Organ

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the Drosophila lymph gland&#8212;the primary site of hematopoiesis in the fly larva&#8212;and shows an example protocol to dissect and mount the organ for immunohistochemistry and fluorescent imaging.

דיסקציה של בלוטת הלימפה בזחל: בידוד האיבר המייצר המוציטים של דרוזופילה

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes ...

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אוכלוסיות תאי דם Assaying של

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב