. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הכלכלית של הלאומי מדעי הטבע קרנות של סין (31770968) ואת טיינג'ין תוכנית של יישום קרן מחקר טכנולוגיה מתקדמת (17JCZDJC33400).

1. ייצור של שילב-הפרין Starpeg Nanocoating
<ol><li>
סינתזה של הפארין succinimidyl succinate (הפארין-NHS)
	<ol>
<li>שוקלים לצאת 0.69 גר' הפארין, להמיס 2.0 מ של קרח מים יונים.</li>
		<li>שוקלים לצאת 0.23 גרם NHS, מתמוסס ב- 0.5 מ של קרח מים יונים בבקבוקון סיבוב המדרגה.</li>
		<li>שוקלים לצאת 0.77 גר' EDC, מתמוסס ב- 0.5 מ של קרח מים יונים בבקבוקון סיבוב המדרגה.</li>
		<li>מיקס בקופת חולים ופתרונות EDC בבקבוקון סיבוב המדרגה. להשאיר את הפתרון מעורבים על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>Centrifuge את התערובת EDC NHS ב x 5,031 g 10 דקות להסיר את עודף EDC NHS.</li>
		<li>להוסיף 30 מ של אתנול קר תערובת פתרון, צנטריפוגה ב 5,031 x g למשך 10 דקות.<ol>
<li>חזור על פעמיים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת nanocoating starPEG-הפרין
	<ol>
<li>להוסיף 1.0 מ"ל של 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 בקבוקון סיבוב המדרגה.</li>
		<li>להוסיף 0.67 מיליליטר 10% (w/v) הפארין-NHS. הבקבוק באותו סיבוב המדרגה.</li>
		<li>למקם את הפתרון מעורבות של starPEG-(NH2)8 , הפארין-NHS באינקובטור 25 ° c במשך 20 דקות להשיג פתרון ברור עם צמיגות. הערה: עבור ניסויים שבהם נדרשה fluorescently שכותרתו הפרין (FAM-הפרין), בהליך ייצור זהה חוץ מזה (NH2) - יתד - כוכב8 היה מומס במים יונים בתוספת 5(6)- carboxyfluorescein N- succinimidyl אסתר 0.1% (היחס טוחנת) starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אפיון של הפארין-יתד nanocoating על ידי פורייה להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום (FT-IR)
	<ol>
<li>לפני שמתחילים, לשטוף אגת פצצות מרגמה, כמוה, pelleting המכשיר (קטן דיסקים בקוטר של 13 מ מ) עם אצטון ומים יונים. יבש את הזכוכית בתנור לפני השימוש.</li>
		<li>מיקס כ 0.1 – 1% מדגם הפארין-יתד עם 200 – 250 מ"ג KBr אבקה.</li>
		<li>מניחים את הפארין-יתד ואת תערובת KBr המליטה אגת, pulverize דק לתוך כדורי פלסטיק קטנים עם קטרים של 2 מיקרומטר.</li>
		<li>להעביר את התערובת לתוך מכשיר pelleting. הפעלת כוח דחיסה גבוהה (8 T/cm2) בריק למשך 1-2 דקות ליצור כדורי שקוף.</li>
		<li>משוך בעדינות את כדורי דגימה מן המכשיר pelleting. יש להיזהר לא תמשכי חזק מדי, אז לא כרוכות סדקים.</li>
		<li>העבר את כדורי מדגם בזהירות רבה פורייה להפוך אינפרא-אדום ספקטרוסקופ לקביעת מבנה כימי מדגם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בחינת נקבובי המבנים הפנימיים של הפארין-יתד nanocoating על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סרוקים (SEM)
	<ol>
<li>ההליכים הבאים, להכין צלחת תרבות תא 48-ובכן תקן פיפטות.</li>
		<li>Pipette הפתרון קופולימר הפארין-יתד לתוך הבארות של צלחת התרבות 48-. טוב.</li>
		<li>להקפיא את הצלחת ב-80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>Lypophilize הדגימות ב-50 ° C בסביבת ואקום (0.1 הרשות הפלסטינית) במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>להפיץ דוגמאות על פני דביק stub אלומיניום.</li>
		<li>מעיל הדגימות עם זהב, להתבונן במיקרוסקופ אלקטרונים סרוקים להתבונן במבנים נקבובי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בחינת השטח nanocoating הפארין-יתד על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)
	<ol>
<li>לנקות סיליקה שקופיות זכוכית עם פתרון פיראניה (70% H2אז4, 30% H2O2) ב 80 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.</li>
		<li>Sonicate השקופיות ב מתנול למשך 10 דקות ולאחר מכן טולואן למשך 10 דקות.</li>
		<li>יבש את השקופיות על-ידי ייבוש ואקום.</li>
		<li>לשטוף את השקופיות עם שפע פתרון 3-aminopropyl-triethoxysilane (2% בטולואן), לנער בעדינות.</li>
		<li>Sonicate השקופיות מתנול עבור 10 דקות ואז טולואן למשך 10 דקות.</li>
		<li>µL מקום 100 בפתרון הפארין-יתד 3% על פני-השטח של השקופיות באמצעות פיפטה סטנדרטי.</li>
		<li>לבחון את פני השטח של הפארין-יתד תחת מיקרוסקופ כוח אטומי (תדר התהודה של 50-80 kHz, כוח קבוע של m N 0.350 21, עצה ברדיוס של 600 ננומטר).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. העכבר איון הנדסה משטח עם הפרין-יתד Nanocoating
<ol><li>
ציפוי פני השטח של איון עכבר עם הפרין-יתד nanocoating
	<ol>
<li>לחלץ איונים עכבר על-ידי collagenase עיכול histopaque מעבר צבע וטיהור דיווח כאמור יופיטר19.</li>
		<li>לבחור. לאישתך איונים 200 תחת מיקרוסקופ לנתיחה על צינור 1.5 מ.</li>
		<li>להוסיף 500 µL ל- PBS איונים, צנטריפוגה ב 503 x g עבור 1 דקות.</li>
		<li>. תוריד את תגובת שיקוע, להוסיף 250 µL של הפתרון הפארין-יתד ולהשאיר את התערובת על קרח במשך 10 דקות פיפטה למעלה ולמטה כדי לאפשר את איונים לערבב היטב עם הפתרון הפארין-יתד.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 503 x g עבור 1 דקות.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע והוסף µL 500 ל- PBS. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 503 g עבור 1 דקות, להסיר את תגובת שיקוע ולשמור על איונים לשימוש נוסף. בחינת איונים העכבר מצופה של הפארין-יתד, FAM-הפרין-יתד שימשה לציפוי איון, בצע את הפעולות הבאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בחינה של העכבר איונים מצופה את nanocoating FAM-הפרין-יתד
	<ol>
<li>להוסיף 1-2 מ ל RPMI 1640 בתוספת 10% לנסיוב שור העובר איונים מצופה ולהעביר איים אלה לתוך תבשיל שאינו טעון התרבות חיידקי סטרילי.</li>
		<li>לבחון את האותות פלורסצנטיות ומורפולוגיה של איים מצופים nanocoating FAM-הפרין-יתד תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הפונקציה של הפארין-יתד מצופה איונים העכבר לעומת איים קטנים שאינם מצופים
<ol><li>
הכדאיות של הפארין-יתד מצופה העכבר איונים
	<ol>
<li>לבחור. לאישתך-20 איונים העכבר הפארין-יתד מצופה ולמקם אותם לתוך אחד טוב של צלחת תרבות תא 96-ובכן.</li>
		<li>למלא סך של בארות 10 20 איונים העכבר הפארין-יתד מצופה במשך כל.</li>
		<li>לבחור. לאישתך 20 של שליטה noncoated איים קטנים ולמקם אותם לתוך באר אחת של תרבות 96-ובכן תא באותה הצלחת.</li>
		<li>למלא סך של בארות 10 20 איונים שליטה noncoated במשך כל.</li>
		<li>לשים 200 µL של RPMI 1640 בתוספת 10% סרום שור עוברית לבאר כל צלחת 96-ובכן המכיל איונים ולתחזק בתרבות למשך 14 ימים.</li>
		<li>החלף איון תרבות המדיה כל יומיים.</li>
		<li>פנקו את איים קטנים עם חי/מת מכתים ערכת בסוף 14 ימים בתרבות והנצפית תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.</li>
		<li>לספור תאים PI+ (אדום) בתוך כל איון תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revascularization של הפארין-יתדות מצופה העכבר איים קטנים בתוך חוץ גופית
	<ol>
<li>מראש מגניב כל פלסטיק ניסיוני כולל צלחת תרבות וטיפים פיפטה לפחות 12 שעות לפני השימוש.</li>
		<li>במקום מקום 24-טוב על משטח קירור. להוסיף 250 µL של קרח קר Matrigel פקטורי גדילה-מופחתת לתוך כל טוב של צלחת התרבות התא 24-. טוב. מקם את הצלחת 24-ובכן מצופה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.</li>
		<li>בעוד הפתרון מטריקס היא הגדרת במקרר, trypsinize הלבלב איון העכבר אנדותל התאים מייל סוון 1 (MS1).<ol>
<li>הסר כל תרבות המדיה הבקבוקון תרביות רקמה. יש לשטוף את הבקבוק עם 5 מ של PBS.</li>
			<li>להסיר את PBS ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין-EDTA. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות חממה סטנדרטי.</li>
			<li>בקלילות הקש על החלק התחתון של הבקבוק כדי לנתק את התאים ולהוסיף 5 מ ל בתוספת-סרום מדיה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאסוף את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות.</li>
		<li>. תוריד את תגובת שיקוע והוסף 5 מ של PBS. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות, להוריד את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף סרום-בתוספת DMEM מדיה לתוך הצינור, זרע 50,000 תאים לבאר כל צלחת 24-ובכן מטריקס פתרון-מצופים.</li>
		<li>להוסיף 5 איים הפארין-יתד מצופה או שליטה noncoated איונים כל טוב.</li>
		<li>להוסיף סרום-בתוספת מדיה DMEM לבאר כל סך של 500 µL לכל טוב.</li>
		<li>להתבונן היווצרות שפופרת לאחר אינקובציה 4 שעות ו- 24 h תחת מיקרוסקופ אור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הפרשת אינסולין הגלוקוז מגורה הפארין-יתד מצופה איונים הערה: כדי להעריך אם nanocoating ישפיע על הפונקציה של העכבר איונים, הפרשת אינסולין הגלוקוז מגורה הפארין-יתד מצופה ושל noncoated נאמד.<ol>
<li>לבחור. לאישתך 30 איים הפארין-יתד מצופה או שליטה noncoated איים קטנים לתוך צינור 1.5 מ ל אחד. להכין סך של צינורות 10 עבור מצופה איים איים noncoated כל.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית, בתוספת mmol/L 2 גלוקוז20 , דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. הערה: על המתכון של הפתרון מלח פיזיולוגית, עיין טבלה 1. שמור את הכובע של צינורות חופשי במהלך הדגירה בחממה.</li>
		<li>הסרת פתרון רב ככל האפשר.</li>
		<li>לעורר איים על-ידי הוספת 600 µL של תמיסת מלח פיזיולוגית בתוספת גלוקוז mmol/L 20 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		<li>לאסוף µL 200 של תגובת שיקוע כל שפופרת לאינסולין כימות אליסה באמצעות אינסולין מסחרי אליסה קיט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction.">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).</li><li>Sarkar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cell+homing.">Engineered cell homing.</a> Blood. 118 (25), 184-191 (2011).</li><li>Kato, M., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+cell+adhesion.">Rewiring cell adhesion.</a> J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).</li><li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+membrane+engineering+for+cell+rolling+using+peptide+conjugation+and+tuning+of+cell-selectin+interaction+kinetics.">Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics.</a> Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).</li><li>Merzaban, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+glycan+engineering+of+neural+stem+cells+augments+neurotropism+and+improves+recovery+in+a+murine+model+of+multiple+sclerosis.">Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis.</a> Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).</li><li>Silvescu, C. I., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-CSF+induces+membrane+expression+of+a+myeloperoxidase+glycvariant+that+operates+as+an+E-selectin+ligand+on+human+myeloid+cells.">G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).</li><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+bioactive+multilayered+nanocoatings+on+pancreatic+islet+cells:+incorporation+of+alpha1-antitrypsin+into+the+coatings.">Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings.</a> Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).</li><li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+surface+bioengineering+with+a+heparin-incorporated+starPEG+nanofilm.">Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).</li><li>Orlando, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+strategies+aimed+at+reconstitution+of+the+beta-cell+compartment+in+type+1+diabetes.">Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).</li><li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets.">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).</li><li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li><li>Kizilel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+pancreatic+islets+with+nano-thin+functional+polyethylene+glycol+coatings+for+enhanced+insulin+secretion.">Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).</li><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+encapsulation+enhances+allograft+survival+and+function+of+islets+transplanted+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).</li><li>Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+deposition+of+antifouling+coatings+on+stainless+steel+via+catechol-amine+reaction.">Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).</li><li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets.">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).</li><li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).</li><li>Zmuda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Gey, G. O., Gey, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+of+human+normal+cells+and+tumor+cells+in+continuous+culture.+I.+Preliminary+report:+Cultivation+of+mesoblastic+tumors+and+normal+tissue+and+notes+on+methods+of+cultivation.">The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation.</a> Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-selective+azide+incorporation+into+endogenous+RNase+A+via+a+"chemistry"+approach.">Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach.</a> Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).</li><li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchoring+of+vascular+endothelial+growth+factor+to+surface-immobilized+heparin+on+pancreatic+islets:+implications+for+stimulating+islet+angiogenesis.">Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).</li><li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+surface+heparinization+prevents+the+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction+in+islet+transplantation.">Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation.</a> Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).</li><li>Asif, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparinization+of+cell+surfaces+with+short+peptide-conjugated+PEG-lipid+regulates+thromboinflammation+in+transplantation+of+human+MSCs+and+hepatocytes.">Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes.</a> Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).</li><li>Teramura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulation+of+cells,+including+islets,+within+stable+ultra-thin+membrane+of+maleimide-conjugated+PEG-lipid+with+multifunctional+crosslinkers.">Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers.</a> Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).</li><li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+nanoencapsulation:+A+nanomedicine+technology+for+diabetes+research+and+management.">Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management.</a> Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במאמר זה נדגים "קל-כדי-לאימוץ" גישה לחיים תא השטח הנדסה nanocoating starPEG שולבו הפארין באמצעות פסאודו-bioorthogonal כימיה בין הקבוצות - hydroxysuccinimide Nnanocoating ו אמין קבוצות של הלבלב איון על פני השטח ממברנה. אכן, הקבוצות אמינו בתוך קרום התא הן מאוד תגובתי, כתוצאה מכך, מחקרים מוקדמים יותר דיווחו על אינטראקציות בין קבוצות אמינו ראשי עם אסתר - hydroxysuccinimidyl (NHS) Nשהופעל בתנאים פיסיולוגיים14 16, ,21. יתר על כן, מחקר מקיף דיווחה כי התאגדות של הפארין, גליקוזאמינוגליקן מאוד sulphated, רכיב חשוב מטריצה חוץ-תאית, במהלך איון כימוס, יכול להוביל משופרת שלאחר השתלת revascularization ו- IBMIR מופחת22,23. בהתחשב את התאימות של פג, המאפיינים multivalent של הפארין, השתמשנו פג חמוש 8 עבור הפארין מקסימלי טוען במהלך ייצור של nanocoating. הפארין שונה עם -NHS, אשר לאחר מכן יגיב עם קבוצות2 -NH על קרום התא איון. בכך שהוא מאפשר היווצרות קשר קוולנטי בין -NH2 (של קרום התא) ו- NHS של Hep-פג, איים קטנים להיות ברצון "מצופה" מאת יתדות שולבו הפארין, ובכך יוצרים שכבה ננו-דק (nanocoating) על המשטח החיצוני של הלבלב איונים.
הגישה הנוכחית היא שונה בשיטות שפורסמו בעבר גם נבחר פג הפולימר העיקריים של איון microencapsulation בכימיה פסאודו-bioorthogonal הזה בין -NHS (של nanocoating) -NH2 של תא איון ממברנה שימש. בהתחשב את היציבות של תא איון ציפוי, במיוחד בסביבה מורכבת כמו הפלזמה, הוא חיוני כדי שלאחר השתלת revascularization, הישרדות, היווצרות בין -NHS -NH2 יהיה יותר יציב בהשוואה הידרופוביות האינטראקציה בין פג, קרום התא24, אלקטרוסטאטיות9,15,24,25,26 או הצמדה ביולוגי בין ביוטין streptavidin14.
בנוסף, בניגוד איון גישה ציפוי המסתמך על הגישה LBL עם איון המורחבת תקופת טיפול רב-שכבתית התצהיר14,16,25, הטכניקה נוכח גם דורשת מינימלי עיבוד וקצר מאוד ציפוי פרק איים מבודדים. שני הגורמים הללו חיוניים להישרדות שלאחר השתלת איון, שכן הכדאיות איונים הוא לעיתים קרובות כבר פרוץ הבאים בידוד איון עקב ECM פגום במהלך עיכול אנזימטי. מגבלה אחת של הגישה נוכח זאת, כי, בניגוד LBL, דרך אשר עובי הציפוי החיצוני יכול להיות נשלט על ידי הגדלת או הקטנת מספר שכבה התצהיר, עובי nanocoating Hep-יתד לא יהיה מותאם לעת עתה.
יתר על כן, בשל מצבו מתון איפה ישימה עבור תא חי תגובה כימית בין -NHS ו- NH2 מתקיים, הגישה נוכח פני הנדסה לא מוגבל לנגרהנס, אבל רוב טיפול בתאי. בנוסף, בהתחשב בעובדה כי הפארין ידועה אינטראקציה עם מגוון של ציטוקינים, מולקולות פעילים ביולוגית, nanocoating Hep-יתד גם מציג פלטפורמה פתוחה בעלת הפוטנציאל של התאגדות של מגשרים ביולוגי ללא הגבלה וכן ממשקים עבור תא מורכב יותר על פני השטח הנדסה.

יעילות טיפולית של טיפולים מבוססי תאים הוא מוגבל על ידי שימור תא נמוך של הישרדות המסכן1,2. על מנת לשפר את התוצאה של טיפולים התא, התא הנדסה השטח באמצעות מניפולציה אנזימטיות, ההטיה פפטיד, כימיה bioorthogonal, כימוס פיזי עם biomaterials כבר מנוצלת3,4, 5,6,7,8,9,10. בפרוטוקול הנוכחי שואפת להשיג הנדסה משטח של תאים חיים באמצעות שיטת "קל-כדי-לאמץ" על-ידי החלת nanocoating starPEG שולבו הפארין זגוגית (הפארין-PEG) של פני השטח של התא. הנדסה משטח של לנגרהנס הוצג כאן כדוגמה בשל אופיו הטרוגנית של איי לנגרהנס ולתוצאות המשפיל של השתלת איון קליני הנוכחי.
אכן, השתלת איון קליני מבוצעת כיום על ידי הזרקה ישירה של איים מבודדים לתוך וריד שער, הליך זה זמין רק עבור חולים סלקטיבי בגלל המחסור התורם חומרים והיעילות הטיפולית נמוך 11. כמקובל, alginate כבר biomaterial הנפוץ ביותר עבור איון כימוס והסבת השטח, למרות שהוא פחות אידיאלי עקב חוסר היציבות הכימית של קילוף פלסטיצידיות, הקשורות דלקתי פיברוזיס12, 13. יתר על כן, בהשוואה לגודל טבעי של איים קטנים הנע בין 100-200 מיקרומטר, מהמיקרו קפסולות alginate-איון הם גדולים, הנעים בין 400 ל-800 מיקרומטר, אשר עולה על המרחק באמצעי פיזיולוגיים של חמצן. איון קונפורמיים כימוס, כלומר. לבצע איונים ללא שינוי משמעותי של איון נפח, פותחה לאחר מכן. כך, הפקדת nanomembranes המורכב פג, tetrafluoroethylene, ממברנות הסיליקון או דווחה nanocoating רב שכבתית (המכונה גם השיטה "--שכבה על" [LBL]), וכתוצאה מכך שיפור במבחנה איון הישרדות14 ,15,16,17,18, למרות LBL הגישה בדרך כלל דורש איונים נרחב מוסר נקודה עבור התצהיר שכבות מרובות, אשר עלול לסכן את הכדאיות איון . יתר על כן, חוסר היציבות של nanomembranes המסתמך על האינטראקציות אלקטרוסטטית או קוולנטיות בין שכבות biomembrane או אינטראקציות הידרופוביות בין nanomembranes לבין השטח איון מעלה גם חששות9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
גורם מגביל נוסף encumbers את התוצאה הטיפולית של השתלת איון intraportal הוא מיידית בתיווך דם דלקתיות התגובה (IBMIR) הנגרמת על ידי מגע ישיר של איים מושתל עם דם, והתוצאה היא הצטברות של טסיות דם, קרישה החיסון השפעה שלילית או בלתי רצויה ההפעלה הסלולרית9. כדי לטפל בבעיות אלו, nanocoating דקים מורכב בצורת כוכב פוליאתילן גליקול (starPEG) הוכן שלה הביו הוקמה ואת הרב-גוניות כמו איון דיור חומר. הפארין, גליקוזאמינוגליקן sulphated מאוד, גם התאגדה בשנת nanocoating starPEG תכונות אנטי דלקתיות, אנטי מקריש, היכולת להקל על vascularization על-ידי גיוס pro-אנגיוגנזה גורמי גדילה22, 23.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armed PEG</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead staining kit</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;, basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

הנדסה פני שטח התא יכול להגן על התאים מושתל מפני התקפות מערכת החיסון המארח. זה יכול לשנות את צורתו גם נוף הסלולר כדי לשפר את תפקוד שתל והישרדות שלאחר השתלת. פרוטוקול זה שואף להשיג הנדסה משטח של לנגרהנס באמצעות nanocoating של starPEG שולבו הפארין זגוגית (Hep-PEG). כדי להפיק את nanocoating Hep-יתד הנדסה משטח הלבלב איון, הפארין succinimidyl succinate (הפארין-NHS) סונתז לראשונה על ידי שינוי של קבוצות carboxylate שלה באמצעות N-(3-dimethylamino propyl) -N'-אתיל carbodiimide הידרוכלוריד (EDC), N- hydroxysuccinimide (NHS). התערובת Hep-יתד ואז נוצרה על ידי crosslinking של אמינו functionalized-סוף ושמונה starPEG (starPEG-(NH2)8), הפארין-NHS. לציפוי השטח איון, העכבר איונים היו מבודדים באמצעות collagenase לעיכול, טיהור מעבר צבע באמצעות Histopaque. איים מבודדים טופלו אז הקרח פתרון Hep-יתד קרים למשך 10 דקות לאפשר קוולנטיות מחייב בין הקבוצות אמין של קרום התא איון NHS. Nanocoating עם המקל-Hep כרוך שינוי מינימלי לגודל איון, ונפח heparinization של איים עם Hep-יתד גם עשוי להפחית מיידית בתיווך דם תגובה דלקתית במהלך השתלת איון. גישה זו "קל-כדי-לאמץ" הוא מתון מספיק עבור הנדסה משטח של תאים חיים מבלי להתפשר על התא הכדאיות. בהתחשב הפארין הוכיח זיקה מחייבת כדי ציטוקינים מרובים, nanocoating Hep-יתד גם מספק פלטפורמה פתוחה המאפשרת התאגדות של מגשרים ביולוגי ללא הגבלה תפקודית ומשטחים רב שכבתית לחיים תא השטח בביו-הנדסה.

Nanocoating הפארין-יתד היה מסונתז על ידי ההטיה של starPEG-(NH2)8 , הפארין באמצעות EDC NHS כמו מצמד סוכנים (איור 1). המבנה הכימי של nanocoating הפארין-יתד נבדק על ידי FT-IR, כפי שמוצג באיור2, פסגות האופיינית של הפארין יכול להיות שנצפו ב- 3,300 – 3,600 ס מ-1, התואם קבוצות הידרוקסיל של הפארין (איור 2 אדום). הירידה משרעת השיא-3,300 – 3,600 ס מ-1 (באיור 2 כחול) מייצג את ההטיה בין starPEG - קבוצות אמיד8 של (NH2) לבין קבוצת קרבוניל; הפארין. משרעת השיא 1,650 ס מ-1 מקביל אמיד קרבוניל מתיחה רטט צומצם גם, המציין תגובה מספקת בין הקבוצות carboxylate של הפארין עם succinimidyl succinate אמין של starPEG-(NH2) 8. מבנה פני השטח nanocoating הפארין-יתד נבדק על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, שהיא מוצגת מ לו. et al., nanocoating היה כ 30 nm, גובה ו 2 מיקרומטר רוחב עם תכונות קטנים מוצרים נקבובי (כתמים כהים) החל בין 100 ל 200 ננומטר בקוטר10. והנתונים שהתקבלו מיקרוסקופיה אלקטרונית סרוקים לאשר גם את מבנה נקבובי מאוד מחוברים של הפארין-יתד (איור 3), רומז כי ייתכן מתאימים להישרדות תא במהלך הלידה אין ויוו.
ציפוי פני השטח של איים מבודדים העכבר נבחנה, כפי שהוצג באיור4, שכבה דקה של nanocoating, המוצגת על-ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק היה אחיד שהופקדו על פני איים מצופה ללא גרימת שינויים ניכר על איון/גודל אמצעי האחסון. במהלך ציפוי, מומלץ לשמור את איים על קרח כדי לשמור על יכולת הקיום שלהם. בדומה לכך, תקופת ציפוי, 10 דקות במקרה זה, היה גם אופטימיזציה כדי לאפשר תחזוקה של הכדאיות איונים. ראוי לציין כי התבוננות טובה יותר nanocoating, מיקרוסקופ אלקטרונים זה בוחן את חתכי רוחב של איים מצופה כפי שדווחה בעבר9,16 יהיה מתאים יותר, למרות הנתונים תופק מ איונים קבוע ומוטבעים במקום המגורים איונים בתרבות.
לגבי ההישרדות והתפקוד של איים מצופה, איון revascularization ובפונקציות כבר המוערך ב חוץ גופית. בהתחשב המועילות של הפארין, הפארין functionalization על גבי המשטח איון יכול להקל על איון revascularization בתרבות, וכתוצאה מכך את הישרדותה. הבחנו כי איים העכבר הפארין-יתד מצופה הציג הכדאיות איון חזקים בתרבות (איור 5). מתקדמת יותר באופן משמעותי היווצרות כלי דם הייתה ניכרת גם איון אנדותל תאים (MS1) היו תרבותי משותף עם הפרין-יתד מצופה איונים, המצוין על-ידי מבנים דמויי-microvessel מוארך ומבנים דמויי רשת כלי הדם (איור 6 ).
תהליך nanocoating שנצברו ללא אפקט גירוי גלוקוז לאינסולין יכולת הפרשה של איים קטנים הפארין-יתד מצופה. רמה נמוכה של הפרשת האינסולין נצפתה בכל קבוצות טיפול כאשר איים קטנים היו perfused עם תמיסת מלח פיזיולוגית, בתוספת sub-stimulatory רמת הגלוקוז (2 mmol/L; איור 7). כאשר איים קטנים היו מגורה ברמה העל-פיזיולוגיים של גלוקוז (גלוקוז mmol/L 20), נצפתה עלייה הפרשת האינסולין בכל קבוצות הטיפול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> איור 1: המבנה הכימי של Hep-יתד nanocoating הנדסה משטח הלבלב איון. איון ציפוי הושגה על ידי crosslinking קוולנטיות בין הפרין-NHS אמינים העיקרי בתוך קרום התא, כוכב - יתד - (NH2)8. כל מולקולה הפרין בעל מספר קבוצות carboxyl, אשר שונו יש את קבוצת NHS בכל. הקבוצות carboxyl מופעל NHS יגיבו אמינים העיקרי של חלבון ל טופס אמיד קישורים, דרך אשר התייצב nanocoating Hep-יתד, איונים. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> איור 2 : ספקטרום אינפרא-אדום של כוכב - יתד - (NH2)8, הפארין ו- Hep-יתד nanocoating ב מיובשים המדינה. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> איור 3: לסרוק תמונות מיקרוסקופיה אלקטרונית של Hep-יתד במצב מיובש. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> איור 4: להחליפן בתמונות של הפארין-יתד מצופה איונים במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. הפארין היה מראש שכותרתה סיפרתי (מוצג בצבע ירוק). התמונות הן נציג של-100 איים קטנים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> איור 5: הפארין-יתד מצופה איונים הציג הכדאיות איון חזקים. (א) נתונים שהוצגו כמו mean± שגיאת תקן של אמצעים, n = 50 איים קטנים לכל קבוצה. (B) מתאים חיים הוצגו תאים מתים וירוק באדום. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. התמונות הן נציג של 50 איים קטנים. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> איור 6: הפארין-יתד nanocoating מקלה אינטרה-איון revascularisation. Matrigel צינור היווצרות של תאים MS1 תרבותי משותף עם הפרין-יתד מצופה איונים ושל שליטה noncoated. התמונות צולמו בבר סולם ה 4 ו- 24 = 100 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> איור 7: Nanocoating הפארין-יתד כרוך ללא שינוי על תפקוד הפרשת אינסולין איון. הפארין-יתד איונים מצופה, שליטה noncoated איים קטנים (30 כל) נחשפו 2 mmol/L (בר לבן) או גלוקוז 20 mmol/L (פס שחור) במשך 30 דקות הפרשת האינסולין בתגובה גלוקוז mmol/L 20 היה דומה בין מצופה ולשלוט איונים. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± שגיאת תקן של אמצעים, n = 10. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating at JoVE.com

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

הנדסה משטח של לנגרהנס עם StarPEG Nanocoating Heparinized

פרוטוקול זה שואף להשיג הנדסה משטח של לנגרהנס באמצעות nanocoating starPEG שולבו הפארין באמצעות פסאודו-bioorthogonal כימיה בין הקבוצות - hydroxysuccinimide Nשל nanocoating הקבוצות אמין של איון קרום התא.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Views.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. פרוטוקול זה שואף להשיג הנדסה משטח של לנגרהנס באמצעות nanocoating starPEG שולבו הפארין באמצעות פסאודו-bioorthogonal כימיה בין הקבוצות - hydroxysuccinimide Nשל nanocoating הקבוצות אמין של איון קרום התא.

Video: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Medicine

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

פיגום נתמך השתלת איים בשומן השומן האפידידימלי של עכברים סוכרתית

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Immunology and Infection

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biology

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of fluorescence staining techniques and confocal microscopy to assess cell viability, apoptosis, and &#946;-cell-specific death. Isolated mouse islets were treated with varying concentrations of a cytokine cocktail, including TNF-&#945;, IL-1&#946;, and IFN-&#947;, to mimic immune-mediated apoptosis during the development of type 1 diabetes. The viability of islet cells was evaluated with FDA/PI dual staining, where FDA conversion to fluorescein indicated viable cells, and PI marked membrane-compromised cells. YOPRO-1 and nuclear staining provided additional data on apoptosis, with Annexin-V confirming early apoptotic cells. Quantitative analysis revealed significant increases in apoptosis and cell death rates in cytokine-treated islets. To specifically assess effects on &#946;-cells, Zn2+ selective indicator staining was used to label insulin-producing cells through the zinc association in insulin granules, revealing substantial &#946;-cell loss following treatment of islets with pro-inflammatory cytokines for 24 h. These multi-staining protocols effectively capture and quantify the extent of cytokine-induced damage in islets and can be used to evaluate therapeutics designed to prevent &#946;-cell apoptosis in early type 1 diabetes.

This study utilizes multi-staining fluorescence-based markers of cell death and apoptosis combined with confocal microscopy to assess cytokine-induced apoptosis and &#946;-cell-specific death in pancreatic islets. It reveals spatial and temporal changes in cell death and apoptosis in response to extracellular stimuli.

טיפול באי לבלב מבודד ומדידת אפופטוזיס

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...