המחברים רוצה להודות המועצה למחקר השבדי (349-2007-8680) למימון, Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, שוודיה) לתרומה של שור בלוטת יותרת הכליה.

<ol>
	<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode.">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li><li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+vesicle:+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile,+multifunctional+secretory+organelle.">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li><li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules.">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33 (1977).</li><li>Winkler, H., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromaffin+granule+and+the+storage+of+catecholamines.">The chromaffin granule and the storage of catecholamines.</a> Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).</li><li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+calcium,+magnesium,+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla.">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li><li>Est&#233;vez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP:+The+crucial+component+of+secretory+vesicles.">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li><li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles.">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li><li>Toll, L., Howard, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mg2++ion-activated+ATPase+and+a+pH+gradient+in+the+storage+of+catecholamines+in+synaptic+vesicles.">Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles.</a> Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li><li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla.">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li><li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells.">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li><li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells.">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li><li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla:+a+nuclear+magnetic+resonance+study.">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li><li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells.">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li><li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions.">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li><li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse.">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li><li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells.">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li><li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis.">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li><li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis.">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li><li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells.">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).</li><li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells.">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li><li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis.">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li><li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells.">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li><li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration.">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li><li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes.">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li><li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes.">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li><li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes.">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li><li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry.">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li><li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde+glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li><li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docked+granules,+the+exocytic+burst,+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells.">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

אנו מציגים כאן פרוטוקול ומהם היתרונות של שילוב שלוש שיטות אנליטיות משלימים לנתח שלפוחית הפרשה ותהליך אקסוציטוזה כדי להשיג הבנה טובה יותר של כיצד כוח פיזי כגון לחץ אוסמוטי יכולות להשפיע על הפרשה שלפוחית בתהליך אקסוציטוזה בתאי הפרשה. שיטות אלה כוללות סיב פחמן microelectrode amperometry, אשר היא שיטה הוקמה עבור הקלטה אקסוציטוזה פעילות, תאיים cytometry אלקטרוכימי, המשמש לקביעת הגודל quantal של שלפוחית בסביבה הטבעית שלהם, ו שידור ניתוח תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים לפקח נפח שלפוחית הפרשה. בעבודה זו, על ידי איסוף נתונים כמותיים של amperometry הקלטות של שלפוחית אחת אקסוציטוזה אירועי תאים chromaffin חשוף מול סביבת חוץ-תאית hypertonic, אישרנו זאת שהזעזוע אוסמוטי מפחית באופן משמעותי כמות נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך אקסוציטוזה והניח כי תאים אלה יכולים הפיכה לשחזר ולשחרר את הכמות המקורית, אם בחזרה לתוך סביבה מול (איור 3).
ההקלטות amperometric סיפק מידע שכיחות של אירועים אקסוציטוזה נגד הזמן, ולכן יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר השינויים בפעילות אקסוציטוזה-תאים בסביבות osmotic שונות. נתונים אלה יכולים להיות מפורש ומשמשת להבחין אם שינויים בפעילות להתרחש באופן מיידי או כפונקציה של הזמן. כפי שהראנו בעבודה הקודמת, למרות הלחץ osmotic הקשו פעילות exocytotic, זה לא נראה יעכבו הפיוז'ן הבריכה releasable ברצון של שלפוחית24. הנתונים פעילות אקסוציטוזה יכול לשמש גם כדי לנתח את הפעילות exocytotic סה כ במהלך תקופה של זמן ההקלטה. כאן אנו מציגים מספר האירועים אקסוציטוזה מ 3 דקות הקלטה של אקסוציטוזה-תאים chromaffin נחשפים שני תנאים osmotic שונים שהצטברו. נתונים אלה מראים על עיכוב בפעילות אקסוציטוזה של התאים חווים מתח osmotic, כי יכולה להיות מושגת החלמה חלקית של פעילות זו לאחר תאים לחזור סביבה מול חוץ-תאית. עם זאת, מאוד חשוב, בקרת ניסויים הראו כי Ba2 + stimulations מרובות בתוך מסגרת זמן שימוש בניסויים אלה נגרמת ירידה משמעותית בפעילות אקסוציטוזה על ידי בכל פעם שתא היה מגורה הפרשת. מאת השלישי ברציפות Ba2 + הגירוי, רק שליש הפעילות אקסוציטוזה נשמר, באופן ברור את הבריום, ואולי גם העיתוי של stimulations בניסויים אלה, היה להשפיע על מחזור שלפוחית. זה יכול להיות רלוונטי המסביר מדוע פעילות exocytotic נמצאה בתאים להציב מול פתרון לאחר ההלם אוסמוטי ומוצג למה תאים אלה ירידה יחסית דומה בפעילות לעומת תאים בתנאים מול אחרי שלוש Ba רציפים2 + stimulations. לפיכך, amperometry הקלטה של אקסוציטוזה מספק מידע על שלפוחית הפרשה מרגע שהשלפוחיות המוגלתיות מופעלות להתמזג עם קרום פלזמה, שחרור נוירוטרנסמיטורים דרך הנקבובית פיוז'ן. ובכך לשחרר נתונים כמותיים על עצבי שלפוחית אחת, ניתן לאסוף מידע על הפעילות אקסוציטוזה.
כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר יכול להיות מוסדר על ידי המצב של אקסוציטוזה המופעלת, איפה שלפוחית מלאה תוכן או חלק התוכן הוא שוחרר. בלמדם אך ורק אקסוציטוזה לשחרר באמצעות סיב פחמן amperometry זה רק מזהה מה נפלט מן שלפוחית, קשה להבחין אם שינוי כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר שזוהו קשורה שינוי מצב מופעלות של אקסוציטוזה, שינוי במאפייני biophysical הסלולר המשפיעים על שחרור תוכן שלפוחית או שינויים בגודל quantal שלפוחית. לכן על ידי משלימים את ההקלטה amperometric של אקסוציטוזה עם מדידות באמצעות של cytometry אלקטרוכימי תאיים, מדידות בחיי עיר בגודל quantal שלפוחית על תאים חיים יכול להיות מאופיין, ועל כן הוא משמש כדי להשוות שבר של שחרור תוכן שלפוחית מן שלפוחית במהלך אקסוציטוזה26.
בעבודה זו, כדי לחקור אם גודל quantal שלפוחית הושפע osmotic מתח, והגשנו בקשה זו טכניקה כימות והערכה של שלפוחית בגודל quantal-התאים חשופים מול ותנאי hypertonic. החדרת אלקטרודה nanotip לתוך הציטופלסמה של תא חי נחשב פולשני למדי, ניסויים אלה בוצעו רק פעם אחת בכל תא, לא נישנו באותו התא. לכן, ניסויים אלה מבוצעות מעדיפים כמו מדידות מקבוצות של תאים שנבחרו באקראי חשוף מול סביבה hypertonic חוץ-תאית. כדי להשוות בין השינויים שלפוחית בגודל quantal כפי שהוא נמדד cytometry אלקטרוכימי תאיים על שינויים נוירוטרנסמיטר הסכום שוחרר ב אקסוציטוזה, שצריך לשקול התאמת התנאים ניסיוני של הקלטה תאיים, גם לבצע הקלטה amperometry של אקסוציטוזה-תאים אקראי נפרדים. אם מחקרים מתבצעים לאותו תא יחיד, חשוב אלה בפרוטוקולים ניסיוניים לשקול גם את השפעת ברציפות BaCl2 stimulations, וכדי להבטיח שהתנאים ניסיוני תואמים לאלה המשמש עבור cytometry תאיים מדידות. זה גם ראוי לציין כי קשה לשלוט על המיקום המדויק או עומק של האלקטרודה כאשר מוכנס לתוך התא. לפיכך, כל תא מספק מדגם אקראי לניתוח שלפוחית בגודל quantal. בנוסף, חיטוט שלפוחית בגודל quantal בשיטה זו אינו מבחין הבדלים, למשל, שלפוחית לבגרות, ולכן גם אם יורשה לי להוסיף וריאציה למדידות. תאיים הניסויים הראו כי גודל quantal שלפוחית צומצם ב תאים חשופים ללחץ אוסמוטי חוץ-תאית. ההפחתה היחסית בגודל quantal זוהה על ידי שיטה זו נמשל התצפיות של שינויים יחסית שחרור נוירוטרנסמיטר במהלך אקסוציטוזה. במחקר זה נמצא כי הירידה היחסית של גודל quantal היה באותו הסדר כמו ירידה שחרור נוירוטרנסמיטר תאי חישה osmotic מתח.
כדי לוודא אם הלחץ osmotic היה שינוי הריכוז עצבי שלפוחית, האחסון שלפוחית הוערך באמצעות הדמיה ניתוח של תאים chromaffin כימי קבוע שהיה חשוף מול ותנאי hypertonic TEM. TEM הדמיה ניתוח הראה כי שלפוחית להתכווץ כאשר תאים נחשפים מכת אוסמוטי כי ההפחתה היחסית בגודל מותאם יחד עם שלפוחית בגודל quantal כדי לשמור על ריכוז של עצבי קבוע24. הניתוח של תמונת TEM, אשר מספק רזולוציה של תמונה ננומטר יכולים להבחין בין שני שלבים, מטריקס חלבון הליבה צפופה והפתרון ההילה שמסביב בתוך LDCVs, ובכך מאפשרת לך לקבוע את עוצמת הקול של מטריקס חלבון הליבה צפופה, חישוב הנפח של הפתרון הילה. בניתוח, הירידה בהיקף שלפוחית היה נחוש בדעתו להיות קשורות בעיקר באמצעי אחסון שמפחית מהפתרון ההילה המקיפה את מטריקס חלבון הליבה צפופה24.
לסיכום, זה מציג מחקר פרוטוקול הממחיש כיצד שלוש שיטות אנליטיות משולב, ומאפשר את האפיון של שלפוחית הפרשה לפני עצבי שחרור ומה משתחררים מן שלפוחית אלה כאשר תאים מופעלות כדי אקסוציטוזה, כדי להשיג הבנה טובה יותר של שלפוחית איך הפרשה וסלולרי פונקציות כמו אקסוציטוזה מושפע על ידי מתח חוץ-תאית. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לסייע לענות על שאלות על איך עצבי לשחרר את אקסוציטוזה, גודל quantal שלפוחית מושפע על ידי שינויים אחרים בסביבה הפיזית או על ידי תרופות עשוי להשפיע על התאים מפרישים.

Chromaffin תאים בבלוטות יותרת הכליה הם תאים נוירואנדוקריניים שחרור נוירוטרנסמיטר מולקולות לתוך זרם הדם. מצב זה מתרחש דרך הסלולר התהליך הכרוך עגינה של פיוז'ן של שלפוחית מלאה נוירוטרנסמיטר, וכתוצאה מכך שחרור תוכן שלפוחית למרחב חוץ-תאית בתהליך הנקרא אקסוציטוזה. נוירוטרנסמיטרים תאים chromaffin (אדרנלין, ונוראדרנלין) מועבר על ידי קרום חלבונים לתוך שלפוחית גדול ליבה צפופה (LDCVs) ומאוחסנים באופן פעיל-ריכוזים גבוהים (~0.5-1 מ')1,2. הצטברות של נוירוטרנסמיטורים פנימה LDCVs מושגת על ידי בזיקה של מולקולות קטכולאמין למטריקס חלבון intravesicular ליבה צפופה המורכבת chromogranin חלבונים (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6ופתרון קוקטייל intravesicular המכיל רכיבי מפתח קטכולאמין העמסה ואחסון לתוך שלפוחית כגון ATP (125-300 מ מ)7, Ca2 + (50-100 מיקרומטר פתרון ו ~ 40 מ מ חייב מטריקס חלבון)8,9מ ג2 + (5 מ מ), ascorbate (10-30 מ מ)10ו- pH של ~5.511,12. LDCVs לשמור על תנאי iso-osmotic עם תא הציטופלסמה (310 mOsm/kg)13, למרות הריכוז ממס תיאורטי בתוך השלפוחיות המוגלתיות לסכם עד יותר מ 750 מ"מ. ההרכב של הרכיבים intravesicular חיוני לא רק עבור העמסה ואחסון של catecholamines, אלא גם לצורך צבירת של מומסים בגבול למטריקס חלבון הליבה צפופה. זה מפחית באופן משמעותי את osmolarity של השלפוחיות המוגלתיות פוחת באופן משמעותי והוא יכול להשפיע על קטכולאמין סכום זה הוא שוחרר במהלך אקסוציטוזה5,6.
מחקרים על ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על התהליך אקסוציטוזה הקלטה amperometric דיווחו על הזאת לחץ אוסמוטי גבוה חוץ-תאית מעכב פעילות אקסוציטוזה ומפחיתה את מספר הנוירוטרנסמיטרים המופרשים יחיד שלפוחית תאים4,14,15,16,17,18,19. ההסברים מתצפיות אלה העריכו על שיפור אפשרי של הצפיפות macromolecular את האירועים של התא הציטופלסמה פיוז'ן שלפוחית מעכבות, שינוי במאפייני biophysical ממברנה להשפיע על מספר נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך אקסוציטוזה. מחשבות אלו הניחו כי מתח נפשי גבוה osmotic חוץ-תאית אינה משפיעה על גודל quantal שלפוחית, אשר מגדירה את מספר מולקולות עצבי המאוחסן בתא שלפוחית בשלב קודם של אקסוציטוזה מופעלות14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. במדידות amperometric של שחרור אקסוציטוזה תאים בודדים, microelectrode דיסק סיבי פחמן מושם בקשר הדוק עם פני השטח של התא, יצירת ערכה ניסוי למעלה מחקה את תצורת סינפסה, איפה amperometric אלקטרודה משמש22,גלאי postsynaptic (איור 1)23. על ידי גירוי תא אקסוציטוזה, אחד יכול לגרום שלפוחית מלאה עצבי נתיך עם קרום פלזמה התא ולשחרר חלק או את התוכן שלפוחית מלאה לחלל חוץ-תאית. מולקולות אלה הנוירוטרנסמיטר משוחרר על פני השטח של האלקטרודה ניתן להבחין electrochemically אם נוירוטרנסמיטורים הם electroactive (למשל, catecholamines) על-ידי החלת פוטנציאלי חמצון-חיזור של +700 mV vs אלקטרודה הפניה של Ag/AgCl . כתוצאה מכך, סדרה של קוצים הנוכחי לסמן את הגילוי של אירועים בודדים אקסוציטוזה. הנוכחי לעומת עקיבה זמן הקלטת amperometric, האזור שמתחת לכל ספייק amperometric יחיד מייצג את המטען זוהה לכל אירוע אקסוציטוזה, ניתן להמיר את החפרפרת של נוירוטרנסמיטרים שוחרר, באמצעות המשוואה פאראדיי. לפיכך, ההקלטות amperometric לספק מידע כמותי על כמות נוירוטרנסמיטורים שגורשו אירועים אקסוציטוזה יחיד, הדו ח על התדר של אירועים אקסוציטוזה, אבל לא מציגות מידע כמותי על השלפוחיות המוגלתיות הפרשה תוכן לפני שחרור נוירוטרנסמיטר וה פיוז'ן שלפוחית החל.
לכן, כדי לקבל הבנה טובה יותר של שלפוחית איך הפרשה בתא הציטופלסמה להגיב חוץ-תאי הלחץ osmotic לפני התא מופעלת בתהליך אקסוציטוזה, שיטות אנליטיות משלימים אחרים יכול לשמש כדי להעשיר את המידע הזה. למשל, כדי לחקור אם הלחץ osmotic הפיצולים נפח שלפוחית, במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הדמיה ניתוח יכול לשמש כדי למדוד את גודל שלפוחית של תאים לאחר קיבוע כימי. כדי לבחון אם osmotic לחץ משפיע על גודל quantal שלפוחית, amperometric פיתחה לאחרונה בטכניקה הקרויה תאיים cytometry אלקטרוכימי, יכול להיות מיושם על כימות של שלפוחית תוכן עצבי ב שלפוחית הפרשה ב שלהם מצב מקורי כאשר בעובדי בציטופלסמה של תאים חיים26. בשיטה תאיים cytometry אלקטרוכימי, אלקטרודה סיב פחמן גלילי nanotip בעדינות מוכנס לתוך הציטופלסמה של תאים חיים, על-ידי החלת +700 mV פוטנציאל אלקטרודה זו (לעומת Ag/AgCl להפנות אלקטרודה), קטכולאמין תכולת שלפוחית ניתן לכמת על ידי הגילוי של יתד הנוכחי חמצון-חיזור של שלפוחית אחת מתנגשים, adsorbing, ולא לאחר מכן stochastically קריעה על פני האלקטרודה, ובכך לשחרר את תוכנם נגד אלקטרודה משטח26. לפיכך, amperometric הנוכחי לעומת זמן מעקב, כל אירוע rupturing שלפוחית יחיד יכול לגרום ארעי הנוכחי ו, בהכניסו את האזור של ספייק הנוכחי כל, הגודל quantal שלפוחית ניתן לחשב באמצעות חוק Faraday´s.
לכן, על-ידי קישור המידע הכמותי שנרכשו מ מדידות גודל שלפוחית באמצעות הדמיה TEM יחד עם שלפוחית בגודל quantal ניתוח, כפי שנרשם על ידי תאיים cytometry אלקטרוכימי, שלפוחית עצבי הריכוז יכול גם להיות נחושים. זה מאפשר שלפוחית אפיון כאשר התאים חשופים למצבים שונים osmotic ומספק תצוגה טובה יותר על איך שלפוחית עשויים להגיב חוץ-תאי הלחץ osmotic בשלב לפני אקסוציטוזה. התוצאות של שילוב שיטות אלה הראו כי בנוכחות לחץ אוסמוטי גבוה חוץ-תאית, שלפוחית להתכווץ ולהתאים את גודלם quantal השוואת מידע כמותי על השינויים היחסיים של מדידות אלה מראה כי תוך כדי כיווץ, שלפוחית להתאים את התוכן ואת גודל כדי לשמור על ריכוז של עצבי קבוע24. לכן, הבנה זו הוא ערך שם מתחבר תצפיותיו על שחרור נוירוטרנסמיטר בתאים שנחשפו ללחץ osmotic. בפרוטוקולים אלה, אנו מתארים את השימוש האלה מתודולוגיות משלימות שלושה המאפשרים אפיון שלפוחית איך הפרשה ב שלהם לסביבתם הטבעית להגיב osmolality חוץ-תאית, את ההשפעות של תגובה זו על אקסוציטוזה תהליך. בנוסף התצפיות הקודמות לגבי ההשפעה של לחץ אוסמוטי גבוה על אקסוציטוזה24, אנו מציגים ניסויים נוספים המתארים תא התאוששות לאחר הלם אוסמוטי ואת השפעת stimulations בריום מרובים ב- chromaffin תאים.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche, Sweden</td><td>11 213 857 001</td><td></td></tr><tr><td>100-&amp;micro;M Nylon mesh</td><td>Fisher Sientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1677</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV coated 60 mm plastic dish</td><td>VWR</td><td>354416</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Sutter instrument Co., Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishing Inc., Japan</td><td>PE-21</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy solutions (A and B)</td><td>Epoxy technology, Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beveller</td><td>Narishing Inc.</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp Instrument</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh Instrument Inc., USA</td><td>PCS-5000</td><td></td></tr><tr><td>Butane Flame</td><td>Multiflame AB, H&amp;auml;sselholm, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Omega</td><td>Leo 912 AB</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring the effect of osmotic stress on secretory vesicles and exocytosis

הקלטה Amperometry של תאים נתון שוק אוסמוטי מראים כי תאים הפרשה להגיב על הלחץ הפיזי הזה על-ידי הפחתת הפעילות אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שוחרר מן שלפוחית באירועים אקסוציטוזה יחיד. הוצע כי הירידה נוירוטרנסמיטורים גורשו היא עקב שינויים במאפייני biophysical ממברנה כאשר תאים להתכווץ בתגובה ללחץ osmotic עם ההנחות זה שלפוחית הפרשה בציטופלסמה תא אינן מושפעות על ידי מתח osmotic חוץ-תאית. Amperometry הקלטה של אקסוציטוזה מפקחת מה הוא שוחרר מן התאים הרגע שלפוחית ולספות עם קרום פלזמה, אך אינו מספק מידע על תוכן שלפוחית לפני המיזוג שלפוחית מופעלת. לכן, על ידי שילוב של amperometry הקלטה עם שיטות אנליטיות משלימים אחרים המסוגלים אפיון השלפוחיות המוגלתיות הפרשה לפני אקסוציטוזה-תאים המופעלת מציע סקירה רחבה יותר לבחינת שלפוחית איך הפרשה ו בתהליך אקסוציטוזה מושפעים שוק אוסמוטי. כאן נתאר כיצד משלימים amperometry הקלטה עם cytometry אלקטרוכימי תאיים והדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) שידור ניתן להשתמש כדי לאפיין שינויים בגודל שלפוחית הפרשה ותוכן עצבי- תאים chromaffin ביחס אקסוציטוזה פעילות לפני ואחרי חשיפה osmotic מתח. על-ידי קישור כמותיים המידע שנצבר ניסויים באמצעות כל שלוש שיטות אנליטיות, מסקנות בעבר נעשו כי הפרשה שלפוחית להגיב ללחץ osmotic חוץ-תאית על ידי כיווץ גודל הקטנת גודל quantal שלפוחית כדי לשמור על ריכוז עצבי קבוע שלפוחית. ומכאן, זה נותן קצת הבהרה בנוגע למה שלפוחית, בתגובה osmotic מתח, להפחית את כמות נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך שחרור אקסוציטוזה. ההקלטות amperometric כאן מציינים שזה הוא תהליך הפיך, את שלפוחית לאחר הלם אוסמוטי והינם מחודשים עם נוירוטרנסמיטורים כאשר תאים שמוקם הם להחזירה לתוך סביבה מול.

נתאר כאן את הפרוטוקול עבור איך שילוב הדמיה TEM יחד עם שתי מתודולוגיות אלקטרוכימי, סיבי פחמן amperometry ותאיים cytometry אלקטרוכימי, יכול לספק מידע רווחים מבט רחב יותר על השפעת חוץ-תאי לחץ אוסמוטי על שלפוחית הפרשה ותהליך אקסוציטוזה. על ידי השוואת amperometric נציג הקלטות של שחרור אקסוציטוזה תאים chromaffin בודדים באמצעות את ניסיוני להגדיר (ראה איור 1), ירידה משמעותית בפעילות exocytotic היה מוצג כאשר תאים נחשפו osmotic דגש לעומת תאים בתנאים מול (איור 2 א)24. מן ההקלטות האלה ועל -ידי שימוש Faraday´s החוק, והעלות הכוללת זוהה על ידי כל amperometric בודדים הנוכחי ספייק שימש כדי לחשב את מספר מולקולות שגורשו שלפוחית אחת אקסוציטוזה אירועי תאים נחשפים השונות osmotic תנאים. לשם השוואה, כפי שהוא מוצג ביישום 2B איור על ידי אזור קטן יותר amperometric הממוצע הנוכחי ספייק זוהה על ידי תאים בפתרון hypertonic, מולקולות עצבי שוחררו כל שלפוחית על-ידי תאי חישה מתח osmotic24 .
כדי לקבוע את הפיכות של ירידה זו מספר מולקולות הנוירוטרנסמיטר משוחרר, ביצענו amperometric הקלטות של אקסוציטוזה התאים חשופים לסביבה hypertonic ובבית, לאחר מכן, תאים לאחר להציב בחזרה לתוך מול סביבה. בניסויים אלה, תאים chromaffin היו מגורה שלוש פעמים ברציפות עם פתרון2 BaCl: לראשונה ב מאגר מול, ואחריו גירוי השני לאחר התאים היו הדגירה למשך 10 דקות פתרון hypertonic ו, לבסוף, שליש גירוי לאחר 10 דקות הדגירה תא בתנאים מול. התוצאות כפי שהוא מוצג ביישום איור 3A להציג כמות נוירוטרנסמיטורים שוחרר צומצם על ידי ~ 50% כאשר תאים נחשפו לתנאי hypertonic, בהשוואה ל- Ba2 + הגירוי הראשון מול מצב. לאחר מכן, כאשר התאים היו החזיר לסביבה מול ונחשפו שלישי Ba2 + גירוי, נוירוטרנסמיטר הסכום שוחרר לכל אירוע אקסוציטוזה היה הפוך בחזרה את הסכום המקורי הוקלט ב הגירוי הראשון, אשר אישר תצפיות הקודם14. בקרת ניסויים עם שלושה רצופים Ba2 + stimulations של תאים בתוך התנאי מול (ראה איור 3B) להראות כי מספר רציפים Ba2 + stimulations בתנאים מול לא לשנות נוירוטרנסמיטר כמות שוחרר במהלך אקסוציטוזה. הדבר מצביע על כך גודל quantal שלפוחית הפיכה ובמהירות מותאם עם osmolarity חוץ-תאית.
עם זאת, בעת ניתוח עקבות amperometric של ניסויים אלה מבחינת פעילות אקסוציטוזה, התברר, כפי שמוצג באיור 4A, הפעילות אקסוציטוזה היה הקשו באופן משמעותי כאשר תאים נחשפו מתח hypertonic. במהלך מתח osmotic, אירועים אקסוציטוזה הצטמצם ל 12% מכלל פעילות תאים במצב מול. לאחר מכן, לאחר הלם אוסמוטי של התאים הונחו בחזרה לתוך סביבה isosmotic, תאים חזרה 41% של פעילותם אקסוציטוזה המקורי. מעניין, הניסויים שליטה הופיעה מול התנאים הראה, כפי שהוא מוצג ביישום איור 4B, כי לאחר ביצוע שלוש stimulations BaCl2 רצופים, התדירות של אירועים אקסוציטוזה צומצם ל-53% לאחר גירוי השני עוד יותר עד 26% על ידי גירוי השלישי לעומת הגירוי הראשון. לפיכך, ברור כי עוקבים Ba2 + stimulations לא נראה משפיעה על מספר הנוירוטרנסמיטרים שוחררו כל שלפוחית אקסוציטוזה מופעלת, אך הוא המשפיעים באופן משמעותי את היעילות של תהליך השחרור שלפוחית.
לחקור איך הפרשה שלפוחית לסביבתם הטבעית שלהם מושפעים חוץ-תאי הלחץ osmotic מבחינת נפח שלפוחית או גודל quantal, שלפוחית בגודל ניתוח באמצעות הדמיה TEM היה בשילוב עם cytometry אלקטרוכימי תאיים-תאים חשופים מול ותנאי hypertonic. בניסויים תאיים cytometry אלקטרוכימי, אלקטרודה nanotip סיבי פחמן הוכנס לתוך הציטופלסמה של תאים chromaffin חיים כאשר הם ממוקמים בפתרון מול hypertonic (כפי שמוצג באיור5). הדקר הנוכחי וכתוצאה מכך amperometric היה פיקוח של כל שלפוחית בציטופלסמה תא מתנגשים, adsorbing, stochastically קריעה ושחרור תוכן שלפוחית על פני השטח של האלקטרודה amperometric על מתפוצץ26. והעלות הכוללת משולב זוהה עבור כל שיא הנוכחית לעומת עקבות הזמן שימש כדי לחשב את הגודל quantal של שלפוחית הממוצע בכל תא הקלטה בחוק Faraday´s. אלה מדידות תאיים cytometry אלקטרוכימי, המוצגת באיור 6 , איור 7 ב, הראו כי שלפוחית בגודל quantal-התאים חשופים ללחץ osmotic הצטמצמו באופן משמעותי בהשוואה ל- תאים בתנאים מול. השוואת הגודל של שינוי בגודל quantal שלפוחית, כפי שהיא נמדדת על ידי cytometry אלקטרוכימי תאיים, כדי הירידה החלקי של כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך אקסוציטוזה-התאים חווים מתח osmotic חוץ-תאית , הראה ירידה יחסית של 60% גודל quantal והן נוירוטרנסמיטר הסכום שוחרר בהשוואה ל- תאים מול התנאים (איור 7)24. להתייחס ההתאמה בגודל quantal שלפוחית וריאציה אפשרית שלפוחית עצבי ריכוז התאים חווים לחץ אוסמוטי, בוצע ניתוח תמונת TEM כדי לקבוע את גודלו שלפוחית של תאים חשופים מול ו hypertonic תנאים. יתר על כן, צביעה כהה של ליבה צפופה חלבון המטריקס שבתוך LDCVs זה הוא מדמיין של תמונות TEM כמו כדור כהה ממברנה מאוגד שלפוחית שימש כדי למדוד את עוצמת הקול של מטריקס ליבה צפופה בתוך שלפוחית אלה. כפי שהוצג באיור8, שלפוחית בגודל צומצם ל 60%-התאים חשופים ללחץ osmotic חוץ-תאית, בהשוואה ל- תאים בתנאים מול. מן הנפח מחושב של הקוטר מדודה של LDCV את והליבה צפופה, הנפח של הפתרון ההילה שמסביב שמופיע כמו פתרון ברור פנימה LDCVs של תמונות TEM גם חושבה. התוצאות מסוכמים מניתוח תמונת TEM הראו, כפי שמוצג באיור 8, כי במהלך חוץ-תאי אוסמוטי הלם זה בעיקר צמצם עוצמת הקול של הפתרון הילה ב- LDCVs זה24.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig1.jpg"> איור 1 : תא בודד אקסוציטוזה amperometry. תיאור סכמטי של הגדרת ניסיוני למדידת amperometric אקסוציטוזה-יחיד chromaffin תאים24. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56537/56537fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig2.jpg"> איור 2: Amperometric רשמים מן המידות אקסוציטוזה.  ( א) הקלטה amperometric הנציגה של אקסוציטוזה-תאים chromaffin מול (צבע שחור), בסביבות חוץ-תאית hypertonic (צבע אדום). (B) הגדלה של ספייק amperometric הממוצע של אקסוציטוזה מדידה של תאים chromaffin מול (שחור) hypertonic סביבות חוץ-תאית (אדום)24. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56537/56537fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig3.jpg"> איור 3 : הפיכות של מספר catecholamines שוחרר ב אקסוציטוזה אפטרשוק אוסמוטי. (א) מספר מולקולות שפורסמו במהלך אקסוציטוזה מתאי chromaffin (n = 4) על ידי שלושה ברציפות Ba2 + stimulations, עם הגירוי הראשון במול, השני ב hypertonic, והשלישי מול מאגר. תוצאות מבחן t אינטראקצית סטטיסטי מוצגים. ערך p -לשם השוואה של ראשון Ba2 + הגירוי (Ba2 + סאונד 1) מול מאגר עם השני Ba2 + הגירוי (Ba2 + סאונד 2) במאגר hypertonic הוא p= 0.1088 ו- p-value עבור ההשוואה של השני Ba2 + הגירוי בפתרון hypertonic עם השלישי Ba2 + הגירוי (Ba2 + סאונד 3) מול מאגר היא p = 0.059. (B) בקרת הניסוי הממחיש את כמות מולקולות הנוירוטרנסמיטר שפורסם בבית שלושה ברציפות Ba2 + stimulations של תאים chromaffin (n = 4) מול מאגר. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56537/56537fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig4.jpg"> איור 4 : השפעת לחץ אוסמוטי על פעילות אקסוציטוזה. (א) השפעת osmolarity חוץ-תאית בפעילות אקסוציטוזה מוצג התדירות של אירועים אקסוציטוזה כאשר chromaffin תאים (n = 4) מומרץ עם הפתרון בריום מול, אז hypertonic, ולבסוף בתנאים מול. הערכים המוצגים כדמויות המספר הממוצע של קוצים של כל תא, הממוצע של כל התאים שנדגמו (שגיאת התקן של הממוצע (SEM)). המשמעות הסטטיסטית של שינויים מוצג באמצעות מבחן t עבור נתונים אינטראקצית ( p -הערך עבור תואר ראשון מול2 + 1 גירוי ועירור hypertonic Ba2 + 2 הוא p= 0.0126, p-ערך עבור השוואה של hypertonic Ba2 + גירוי 2, מול Ba2 + גירוי 3 הוא p= 0.037). (B) בקרת הניסוי מציגים את התדירות של אירועים אקסוציטוזה לאחר שלושה stimulations בריום רצופים על תאים chromaffin (n = 4) בתנאים מול. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56537/56537fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig5.jpg"> איור 5 : שלפוחית תאיים cytometry אלקטרוכימי כדי לעקוב אחר השינויים בגודל quantal שלפוחית. (א) סכימטי של ניסיוני להגדיר משמשת עבור cytometry אלקטרוכימי תאיים. (B) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה של אלקטרודה חרוט סיבי פחמן טיפוסי nanotip24. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56537/56537fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig6.jpg"> איור 6 : מדידות cytometry אלקטרוכימי תאיים מציג (א) עקבות נציג של ההקלטות cytometry תאיים amperometric תאים chromaffin מול (שחור) hypertonic (אדום) סביבות חוץ-תאית. (B) הגדלה של ספייק amperometric הממוצע של מדידה cytometry תאיים על תאים chromaffin מול (שחור) hypertonic סביבות חוץ-תאית (אדום)24. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56537/56537fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig7.jpg"> איור 7 : כימות של מספר catecholamines שוחרר ב אקסוציטוזה והנחישות של שלפוחית בגודל quantal. (א) את המספר הממוצע של מולקולות שפורסמו במהלך ההקלטות אקסוציטוזה תאים chromaffin מול (n = 22), hypertonic (n = 20) סביבות. הערכים מוצגים כמו מספר ממוצע של מולקולות ושוחררה לכל אירוע אקסוציטוזה של כל תא, בממוצע את התאים שנדגמו (± SEM). המשמעות הסטטיסטית של שינויים מוצגים באמצעות מבחן t עבור נתונים אינטראקצית (ערךp -= 0.0003) (ב') המספר הממוצע של מולקולות לכל בועית כפי שזוהה על-ידי cytometry אלקטרוכימי תאיים על תאים chromaffin מול (n = 19) ו hypertonic (n = 16) תנאים. הערכים כפי המספר הממוצע של מולקולות לכל ספייק שהוצגו כפי שזוהו של כל תא, בממוצע של כל התאים שנדגמו (± SEM). המשמעות הסטטיסטית של שינויים מוצג באמצעות מבחן t עבור נתונים אינטראקצית (ערךp - = 0.0108)24. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56537/56537fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56537/56537fig8.jpg"> איור 8 : השפעת לחץ אוסמוטי על גודל שלפוחית גדול ליבה צפופה. היקף מחושב את LDCVs, החלבון ליבה צפופה, הפתרון הילה סביב מטריקס חלבון הליבה צפוף היה מחושב באופן attolitres (אי אל) מניתוח תמונת TEM תמונות של תאים chromaffin מול (n = 12) ו hypertonic (n = 9) מאגרים. התוצאות היו נאספו מ ממוצע של שלפוחית 311 בכל תא וממוצעים של תאים בודדים (± SEM). P-בערכים מדווחים אינטראקצית t-השוואות מאגרי מול ו hypertonic. P-value הוא 0.0385 (*) עבור שלפוחית האחסון, 0.3967 עבור האחסון ליבה צפופה, 0.0047 (*) עבור אמצעי האחסון "היילו"24. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56537/56537fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis at JoVE.com

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.

ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

monitoring-effect-osmotic-stress-on-secretory-vesicles

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Views.  Chalmers University of Technology. מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר ...

Video: Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Chemistry

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Immunology and Infection

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Biology

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) is a straightforward way to explore secretion from the lysosomal compartment. Taking advantage of cell culture on micropatterned surfaces to normalize cell shape, a variety of statistical tools were employed to perform a spatial analysis of secretory patterns. Using Ripley&#8217;s K function and a statistical test based on the nearest neighbor distance (NND), we confirmed that secretion from lysosomes is not a random process but shows significant clustering. Of note, our analysis revealed that exocytosis events are also clustered in nonadhesion areas, indicating that adhesion molecules are not the only structures that can induce secretory hot spots at the plasma membrane. Still, we found that cell adhesion enhances clustering. In addition to precisely defined adhesive and nonadhesive areas, the circular geometry of these micropatterns allows the use of polar coordinates, simplifying analyses. We used Kernel Density Estimation (KDE) and the cumulative distribution function on polar coordinates of exocytosis events to identify enriched areas of exocytosis. In ring-shaped micropattern cells, clustering occurred at the border between the adhesive and nonadhesive areas. Our analysis illustrates how statistical tools can be employed to investigate spatial distributions of diverse biological processes.

Live imaging of lysosomal exocytosis on micropatterned cells allows a spatial quantification of this process. Morphology normalization using micropatterns is an outstanding tool to uncover general rules about the spatial distribution of cellular processes.

כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

זיהוי וניתוח אוטומטיים של אקסוציאטוזיס

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

מבוא לאנדיציטוזיס ואקסוציטוזיס

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Cell Biology

An In Vitro Technique to Visualize Exocytosis of Secretory Granules in Mast Cells

Source: Klein, O., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57936">Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique to visualize exocytosis in mast cells. The cells are incubated with FITC-dextran &#8212; a fluorescent reporter &#8212; which is taken up by cells inside secretory granules (SGs), where the acidic pH quenches its fluorescence. Upon stimulation of granule exocytosis, the medium&#39;s higher pH induces reporter fluorescence inside the fused SGs, which is visualized using a fluorescence microscope.

טכניקת מבחנה לדמיין אקסוציטוזה של גרגרי הפרשה בתאי פיטום

1. Preparations

	Preparation of RBL (RBL-2H3 mast cell line) culture media
	
		Mix 500 mL of low glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium ...