Name: a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model
Uploaded: 2018-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIGMS (R01GM11755) כדי P.W.J. על ידי מלגת גראנט ההדרכה מ הלאומי סרטן המכון (NIH) (CA009110) S.R.W., ג'יי-אייץ

השימוש של עכברים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו להשתמש הוועדה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. נערכו ניסויים לנוער (20-26 ימים לכתיבה, dpp) C57BL/6J עכברים, ניצול של הגל הראשון סינכרונית למחצה של יצירת זרע. עם זאת, טכניקה זו ניתן גם לבצע שימוש בעכברים בוגרים.
1. ניתוח ובידוד של העכבר וכמה בקוריאנית
<ol><li>להכין תקן/פירוק פתרון ונוגדן דילול המאגר (ADB) שמתואר בטבלה 1 ו- 2 בטבלה.</li>
	<li>להכין צלחת פטרי אחת של 35 מ מ עם 3 מ ל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (1 x PBS, pH 7.4), תבשיל אחר 35 מ מ עם 2 מ של תיקון/פירוק פתרון לכל העכבר.</li>
	<li>להקריב את העכבר דרך נקע בצוואר הרחם או חנק2 CO, לרסס את הבטן הגחון עם 70% אתנול. פתח את חלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטרילי, עושה חור בצורת V. ואז להסיר את האשכים על ידי משיכת על כרית השומן epididymal באמצעות מלקחיים, ולהימנע מטריד את tunica albuginea. מקם את האשכים בצלוחית 35 מ מ המכיל 1 x PBS. הערה: לנצל את הגל הראשון של יצירת זרע על מנת לצפות אוכלוסיה תא מועשר של עניין14. בשלבים מסוימים של יצירת זרע מועשרים בגילאים שונים בעכבר (טבלה 3).</li>
	<li>הסר את האשכים tunica albuginea על-ידי ניקב את הרקמה עם מלקחיים משופעת חדה ולאסוף את בקוריאנית וכמה רופף. להעביר את בקוריאנית המכיל 2 מ"ל של פתרון תיקון/פירוק פטרי 35 מ מ חדש.</li>
	<li>דגירה של בקוריאנית בפתרון fix/פירוק למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>2. הכנת וכמה בקוריאנית
<ol><li>הכן שקופית פולי-L-ליזין מצופה זכוכית על ידי חלוקה לרמות את הקצוות של השקופית עם עט חוסם נוזלי.</li>
	<li>החל µL 100 של פתרון תיקון/פירוק למרכז השקופית זכוכית.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים סטרילי, מספריים להקניט בעדינות לגזרים את בקוריאנית וכמה. חיתוך צנורית זמן בודדים מגזרים כ 20 מ מ אורך. הערה: לדמיין מבנים רגישים חשיפה ממושכת מקבע, כגון centrosomes, להפריד את בקוריאנית לראשונה ב-, טוב, מגניב 1 x, ואז ישירות מינצ בקוריאנית על פני השטח של השקופיות פולי-ליזין מצופה µL 100 בפתרון fix-פירוק.</li>
	<li>להעביר חמישה קטעים צנורית וכמה זמן 20 מ מ השקופית מוכן פולי-L-ליזין מצופה זכוכית המכיל תיקון/פירוק פתרון.</li>
	<li>באמצעות מספריים סטרילי האוהב בקוריאנית וכמה למקטעים 1.5 ל 3.0 מ מ.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים סטרילי לסדר את מקטעי צנורית בשקופית זכוכית כך אין רקמות חופף, ולא בקוריאנית מפוזרים באופן אחיד. הערה: מספר אופטימלי מקטעי צנורית על משטח זכוכית הוא בין 20 ל- 40.</li>
</ol>3. מועך של בקוריאנית וכמה
<ol><li>להעביר את השקופית זכוכית המכיל מקטעים צנורית וכמה מפוזרת על גבי benchtop. להסיר את עודף נוזל באמצעות מגבון מעבדה כדי להימנע מאובדן רקמת במהלך השלב סקווש.</li>
	<li>להחיל על coverslip (22 x 60-1.5 מ"מ) על גבי השקופית זכוכית והפעילו לחץ על העקב של כף היד למשך 10-20 שניות. חשוב להפעיל מספיק כוח כדי לפזר את spermatocytes מן בקוריאנית וכמה. הערה: לבחון את בקוריאנית באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה על מנת לייעל את הצעד squashing כך כל מקטעי צנורית הם שיבשו.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים שקופיות, מיד פלאש להקפיא השקופית זכוכית דיואר קטנה של נוזל N2 למשך 15 שניות, או עד שהנוזל חודל בועה. אם immunolabeling להסיר לאלתר, את coverslip עם סכין גילוח שוליים ישרים, בסדר עצה מלקחיים או מחט בקוטר 21. הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, immunolabel השקופיות באופן מיידי (ראה שלב 4). עם זאת, בשלב זה שקופיות יכולים להישמר ב-80 מעלות צלזיוס עד שבועיים. כדי להגדיל את אורך החיים של חלבונים ו מבנים הסלולר, מיד מאחסנות את השקופיות קרח יבש או העברת מקפיא-80 ° C, ולשמור את coverslip בשקופית. כאשר immunolabeling לאחסן שקופיות, להסיר את coverslip במועט השקופיות N נוזלי2 למשך 15 שניות, כפי שמתואר בשלב 3.3.</li>
</ol>4. Immunolabeling של בקוריאנית וכמה הנטען
<ol><li>לטבול את השקופית 1 x PBS ולאחר שטיפת שלוש פעמים במשך 5 דקות בתוך צנצנת Coplin 50-mL המכיל 1 x PBS. הערה: לעולם לא. תרשה שהשקופיות יבש לחלוטין במהלך immunolabeling.</li>
	<li>החל מ ל 1 נוגדן מאגר דילול אותן לשקופית זכוכית לחסום במשך 1-2 h בתוך תא humidified.</li>
	<li>להסיר את המאגר דילול נוגדן ולהחיל µL 100 של נוגדן ראשוני מדולל במאגר דילול נוגדן בתוך תא humidified. הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, דגירה נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 º C. השתמש כרכים קטנים של נוגדנים (למשל 50 µL) על ידי כיסוי השקופית עם coverslip או מצלמות-מיקרוסקופים. לאמת ולמטב נוגדנים ראשי15.</li>
	<li>לשטוף שקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות בתוך צנצנת Coplin 50 מ ל המכיל 1 x PBS. הערה: כדי לשפר את מנקי, להתסיס צנצנות Coplin באמצעות בר קטן מערבבים מגנטי, מניחים על צלחת מגנטית מערבבים במהירות נמוכה, או למקם את הצנצנת Coplin על שולחן מערבל במהירות נמוכה.</li>
	<li>החל µL 100 של נוגדנים משניים מדולל במאגר דילול נוגדנים עבור h 1 1.5 בתוך תא humidified בטמפרטורת החדר. דגירה השקופיות בקופסה כהה כדי למנוע צילום הלבנה של נוגדנים fluorophore מצומדת. הערה: השתמש כרכים קטנים של נוגדנים (למשל 50 µL) על ידי כיסוי השקופית עם coverslip או מצלמות-מיקרוסקופים.</li>
	<li>שטיפה שקופיות פעמיים במשך 5 דקות בתוך צנצנת Coplin 50-mL המכיל 1 x PBS.</li>
	<li>הר השקופיות הרכבה בינונית המכיל 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, µg 1.5/mL) ולהחיל coverslips (22 x 60-1.5 מ"מ).</li>
	<li>חותם על coverslips על השקופיות עם לק ברורה כדי לשמר את השקופיות ולמנוע את coverslips לנוע.</li>
</ol>5. ניתוח וההכנות הדמיה צנורית סקווש
<ol><li>השתמש במיקרוסקופ epifluorescence עם שלב אוטומטי המאפשר תנועה ציר z מדויק של מצלמה ברזולוציה גבוהה עבור לכידת תמונה. לחלופין, השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר. הערה: להשתמש בכל תוכנה וחומרה זמין בשלב זה. לדוגמה, התמונות המוצגות באיור 1 ו- 2 איור נלכדו באמצעות Zeiss תא הצופה Z1 מקושר מצלמת CMOS 4.0 אורקה-פלאש וניתח עם התוכנה תמונות מהדורה 2012 זן Zeiss כחול.</li>
	<li>להעריך את השקופיות בעזרת מטרה X 20 כדי לקבוע את איכות התכשיר סקווש. שקופיות באיכות טובה יש של טפט של גרעינים המופצים באופן שווה. הערה: כמה קטעים של השקופית יכול להיות יותר טוב מאחרים, זה שימושי כדי לציין את הקואורדינטות של שם ניתן למצוא את האזורים הטובים ביותר של השקופית לצורך ניתוח נוסף באמצעות הגדלה גבוהה יותר.</li>
	<li>שימוש גבוה יותר אובייקטיבי ההגדלה (למשל 63 X או 100 X), לכידת אזורים של השקופית שיש של טפט עקבית של גרעין האטום. ברגע אזור נבחר, קבע העליון ולהוריד Z-במחסן כדי להבטיח כי כל האור בפוקוס נלכד. הערה: המספר האופטימלי של Z-במחסן נתפס בין הגבול העליון והתחתון מיועד בדרך כלל על ידי תוכנת רכישת התמונה, והוא שונה עבור כל מטרה.</li>
	<li>להשתמש בתמונה בתוכנת עיבוד כדי לקמפל תמונה המוקד עומק מורחב. התוכנה משלבת האור בפוקוס כל Z-מחסנית, חיוני עבור הדמיה אופטימלית של צנורית סקווש ההכנות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+germ+cells+are+created+equal:+Aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis.">Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li><li>Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+meiotic+prophase+I+to+metaphase+I+transition+in+mouse+spermatocytes.">Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes.</a> Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).</li><li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slide+preparation+method+to+preserve+three-dimensional+chromatin+architecture+of+testicular+germ+cells.">Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells.</a> J Vis Exp. (83), e50819 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis:+how+far+from+clinical+application?.">In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?.</a> Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).</li><li>Staub, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+research+on+mammalian+male+germ+cell+meiotic+differentiation+in+vitro.">A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro.</a> J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).</li><li>Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squash+procedure+for+protein+immunolocalization+in+meiotic+cells.">Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells.</a> Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Xu, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cryosection+method+for+mouse+testis+tissue.">A modified cryosection method for mouse testis tissue.</a> Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).</li><li>Hess, R., Moore, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+methods+for+evaluation+of+the+testis.">Histological methods for evaluation of the testis.</a> Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).</li><li>Bellv&#233;, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).</li><li>Bellv&#233;, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+mouse+testis+and+characterization+of+isolated+spermatogenic+cells.">Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells.</a> J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+pairing,+and+synapsis+of+homologs+during+meiosis.">Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+recombination:+the+essence+of+heredity.">Meiotic recombination: the essence of heredity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere+and+telomere+movements+during+early+meiotic+prophase+of+mouse+and+man+are+associated+with+the+onset+of+pairing.">Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing.</a> J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leptotene-zygotene+transition+of+meiosis.">The leptotene-zygotene transition of meiosis.</a> Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).</li><li>Scherthan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bouquet+makes+ends+meet.">A bouquet makes ends meet.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).</li><li>Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Royo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+acts+stage+specifically+to+regulate+multiple+aspects+of+mammalian+meiotic+silencing.">ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing.</a> Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).</li><li>Turner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+unsynapsed+meiotic+chromosomes+in+the+mouse.">Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse.</a> Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).</li><li>Marjanovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEP63+deficiency+promotes+p53-dependent+microcephaly+and+reveals+a+role+for+the+centrosome+in+meiotic+recombination.">CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination.</a> Nat Commun. 6, 7676 (2016).</li><li>Inan&#231;, B., Dodson, H., Morrison, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Centrosome-autonomous+signal+that+involves+centriole+disengagement+permits+centrosome+duplication+in+G2+phase+after+DNA+damage.">A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage.</a> Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mammalian+sperm+cells+identifies+new+components+of+the+centrosome.">Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).</li><li>Fukuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transacting+factor+CBF-A/Hnrnpab+binds+to+the+A2RE/RTS+element+of+protamine+2+mRNA+and+contributes+to+its+translational+regulation+during+mouse+spermatogenesis.">The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).</li><li>Lahn, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Previously+uncharacterized+histone+acetyltransferases+implicated+in+mammalian+spermatogenesis.">Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).</li><li>Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomal+association+of+histone+macroH2A1.2+in+embryonic+stem+cells+and+somatic+cells.">Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells.</a> Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).</li><li>Shanmugam, M., Hernandez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+for+SNAP45,+a+subunit+of+the+small+nuclear+RNA-activating+protein+complex+SNAPc.">Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).</li><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Amory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+spermatogenesis+by+bisdichloroacetyldiamines+is+mediated+by+inhibition+of+testicular+retinoic+acid+biosynthesis.">Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis.</a> J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis.">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li><li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique.">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF/TRF2+gene.">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li><li>Henriks&#233;n, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat:+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations.">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

עכברים הוכיחו להיות אורגניזם מודל שימושי ללמוד את האירועים הסלולר המפקחים על התקדמות meiotic במהלך יצירת זרע. עוד יותר, הוא צורך לפתח כלים ששירתה המחקר של יצירת זרע כי אירועים רבים, כגון יציאה מן meiotic prophase אני, הם dimorphic מינית. פרוטוקול זה מתאר שיטה סקווש צנורית וכמה עבור ויזואליזציה ולימוד בשלב...

מיוזה הוא אירוע הסלולר מורכב שבו סבב אחד של שכפול ה-DNA ואחריו שני כדורים רצופים של חלוקת התא. מספר אירועים ספציפיים מיוזה חייבת להיות מתואמת במהלך בשלבים הראשונים של מיוזה כדי להבטיח הפרדה בין כרומוזום מדויק. אירועים אלו כוללים השלמת רקומבינציה הומולוגית, כיוון משותף של אחותי kinetochores במהלך לליגת העל meiotic, ואובדן stepwise cohesin מתחמי כדי לפתור chiasmata בין homologs. ויסות מדויק של תהליכים אלה הוא הכרחי כדי לשמור על פוריות וכדי למנוע אירועים missegregation כרומוזום זה יכול להוביל גנטי הפרעות התפתחותיות והפלה ספונטנית1.
בזמן האירועים מפתח של מיוזה מתקיימים בזכרים ונקבות, הבדלים משמעותיים הטמפורלי, מכניסטית להתקיים בין יצירת זרע ו oogenesis2. לדוגמה, במהלך המיוזה הנשי, prophase מתרחשת במהלך התפתחות ואני מעצרים בשלב dictyate עד גיל ההתבגרות. לעומת זאת, יצירת זרע מתחילה גיל ההתבגרות ומתקדמת בגלים לאורך כל חיי הבוגרים ללא מעצר. ההבדלים בין זכר ונקבה מיוזה מדגישה את הצורך לפתח שיטות ייענו במיוחד לקראת הערכת תהליכים אלה, הן spermatocytes והן oocytes. כיום, הערכת התקדמות meiotic במידה רבה מסתמך על השימוש של כרומטין כפולות3,4,5. בעוד כרומטין כפולות הם שימושיים ללימוד כרומוזומים meiotic, הם נכשלים לשמר את שלמות הסלולר, מניעת הערכה של מבנים הסלולר כגון ציר microtubules, centrosomes, מעטפת הגרעין, טלומר קבצים מצורפים. חיים הדמיה, טכניקות culturing לטווח ארוך מאוד מתקדמת ההבנה שלנו של מיוזה נקבה; עם זאת, גישות דומות כדי להמחיש את כל התא ללא פגע, בתדירות נמוכה יותר מיושמות לחקר יצירת זרע6,7. על מנת להמחיש את האירועים דינמי במהלך המיוזה זכר, אנחנו הסתגלו צנורית הוקמה טכניקות סקווש להעריך במהירות את התכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes8,9. השיטה המתוארת כאן שומר על שלמות התא, המאפשר לימוד מספר מבנים הסלולר בשלבים שונים של יצירת זרע.
טכניקה זו סקווש צנורית היא גישה כל התא, המאפשר להערכת מבנים הסלולר באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. גישות נפוצות היסטולוגית להמחיש התקדמות meiotic בעכברים זכרים כגון haematoxylin ואאוזין מכתים של פרפין מוטבע האשכים, תיוג immunofluorescent של cryosections לאפשר סקירה רחבה של התקדמות meiotic. עם זאת, שיטות אלה להיכשל לפתור תאים בודדים במידה הנדרשת עבור ניתוח מפורט של האירועים המתרחשים במהלך המיוזה10,11. טכניקות חלופיות כדי לחזות תהליכים meiotic להסתמך על הפרעה chemiosmotic משמעותית spermatocyte כדי לבודד ולפתור חומרים גרעיניים3,4,5. טיפולים כימיים אלה לעכב את ההתבוננות סוגי תאים חוץ spermatocytes הראשי. שיטה תיאר לאחרונה על ידי Namekawa אפשרה את קהילת המחקר לשמר את הארכיטקטורה הגרעין של spermatocytes מבודדים, אך מחייב שימוש cytospin ואביזרים עשויים להיות לא זמינים כמה מעבדות4. לעומת זאת, הטכניקה סקווש צנורית רק דורש ציוד זה מקובל בדרך כלל במעבדות בביולוגיה ברוב של התא.
סקווש צנורית השיטה המתוארת כאן ניתן להמחיש את סוגי תאים מגוונים נמצא בתוך צנורית וכמה, כולל תאי סרטולי, spermatogonia, spermatocytes הראשיים והמשניים של spermatids. על ידי צימוד טכניקה זו עם הגל הראשון ליד סינכרוני של יצירת זרע בעכברים לנוער, זה ניתן לקבל מועשר אוכלוסיות של תאי spermatogenic כפי שהם התקדמות דרך מיוזה12. תהליך זה מאפשר ניתוח מפורט של תהליכי במהלך יצירת זרע, כגון אירועים prophase מוקדם, G2/MI מפה של מעברים "אנאפאזה", spermiogenesis. יתר על כן, ההכנות סקווש צנורית ניתן להמחיש התכונות cytological של כרומוזומים (למשל interchromatid תחומים (ICDs) ו- kinetochores), centrosomes (centrioles ו- pericentriolar חומר/מטריצות). השיטה סקווש ניתן לבצע בקלות במקביל עם גישות אחרות, כגון כפולות כרומטין והפקת חלבונים. בנוסף, טכניקה זו שונתה בהצלחה להפקיד מתאים spermatogenic חיים בשקופיות עבור פריט חזותי ישיר13.
השיטה המתוארת כאן כרוכה טכניקה סקווש צנורית וכמה התא כולו כדי לנתח את המעבר G2/MI בעכברים C57BL/6J פראי-סוג. התכונות cytological של ראשי spermatocytes הזנת לליגת העל meiotic היו דמיינו מיקרוסקופ immunofluorescence להתבונן על ציר meiotic. טכניקה זו תכליתי ניתן לשנות בקלות לדמיין אחרים בשלבים meiotic, סוגי תאים שונים. הטכניקה היא גם נוטה אסטרטגיות ויזואליזציה חלופיים, כגון גישות DNA ו RNA דגים.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Humid Box</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microsopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 blue edition image software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Human anti-Centromere Protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Mouse anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;gamma;H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 in 500</td></tr><tr><td>Mouse anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-REC8</td><td>Courtesy of&amp;nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 in 1000</td></tr></tbody></table>

a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model

התקדמות meiotic של הזכרים הוא תהליך הדורש פעולה מתואמת של מספר אירועים הסלולר בעלות רגולציה. שגיאות שאירעו במהלך המיוזה יכול להוביל פוריות, אובדן הריון או פגמים גנטיים. . מתחיל עם תחילת גיל ההתבגרות וממשיכים לאורך הבגרות, גלים סינכרונית למחצה רציפה של spermatocytes עוברים יצירת זרע, ובסופו של דבר להקים זרע הפלואידי. הגל הראשון של העכבר spermatocytes שעברו חניכה meiotic מופיעים ב יום 10 לכתיבה (10 dpp), משתחררים לתוך לומן של בקוריאנית וכמה כמו זרע בוגרת ב 35 dpp. לכן, זה יתרון כדי לנצל עכברים בתוך חלון הזמן התפתחותית זו כדי להשיג את אוכלוסיות מועשר עניין. ניתוח נדיר תא שלבים קשה יותר בעכברים בוגרים בשל תרומתה של גלים spermatogenic רצופים, אשר מגבירים את המגוון של אוכלוסיות סלולר בתוך בקוריאנית. השיטה המתוארת כאן היא טכניקה מיושמים בקלות על הערכה cytological של התאים המצויים על בקוריאנית וכמה עכברים, כולל spermatogonia, spermatocytes ו- spermatids. הטכניקה סקווש צנורית שומר על השלמות בתאי הנבט זכר מבודדת ומאפשרת בחינת מבנים הסלולר לא דמיינו בקלות עם טכניקות טיפול נוספות. כדי להדגים את היישומים האפשריים של טכניקה זו סקווש צנורית, פלך הרכבה היה בפיקוח spermatocytes להתקדם דרך prophase כדי מפה של שאני מעבר (מעבר G2/MI). בנוסף, שכפול centrosome, כרומוזום מין meiotic איון (MSCI) ואת היווצרות כרומוזום זר היו העריכו דוגמאות של המבנים cytological כי יכול להיות שנצפו בשיטה זו סקווש צנורית. טכניקה זו ניתן לאתר פגמים ספציפיים במהלך יצירת זרע שנגרמות על ידי מוטציה או ההפרעות אקסוגני, וכך, תורם להבנת מולקולרית יצירת זרע.

כאן השתמשנו בשיטת סקווש צנורית להמחיש תא חלוף אוכלוסיות שעברו את prophase כדי מפה של אני (G2/MI) המעבר, אשר היו מועשר בבציר האשכים של עכברים פראי-סוג לנוער העוברים את הגל הראשון של יצירת זרע (24 dpp). איור 1 מציג תמונות נציג של השלבים השונים תא זה ניתן לאבחן באמצעות הש...

Watch this Scientific Journal Video about A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model at JoVE.com

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K Views.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

Video: A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

<meta charset="utf8"></head><body>הליך הזרקת זרע עגול Murine לחקר התפתחות עוברית

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקת זרע עגולה לעכבר

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

נבט השתלת ורקמות testis Xenografting ב עכברים

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Biology

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

נבט השתלת ורקמות testis Xenografting ב עכברים

הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של