עבודה זו נתמכה על ידי MRC את האיחוד האירופי FP7, ARUK, טרסט, בבריטניה פרקינסון. כן נרצה להודות גב' ג'ואנה סרויה שלה התרומה של תמונות קונאפוקלית ואנשי המעבדה לקלט בונה שלהם על כתב היד, מתודולוגיה.

כל הניסויים באמצעות עכברים וחולדות אושרו, שנערך באמצעות לוח זמנים 1 הליכים מכוסה תחת חוק משרד הפנים חיות (וצפייה) 1986. ניתן למצוא את המתכון נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) טבלה 1-
 1. הכנה חריפה פרוסה בהיפוקמפוס <ol><li>מסירים את המוח העכבר מהר ככל האפשר, באמצעות מרית, מספריים לחתוך את הגולגולת, ולמקם אותו תוך קר כקרח, חמצן (95% או 2, 5% CO 2), חנה המבר בסוכרוז (~ 100 מ"ל).</li>
	<li>מקום במוח העכבר על צלחת פטרי ולהסיר את המוח הקטן, קטע קטן של קליפת חזיתית עם איזמל לפני hemisecting את האמצע של המוח-</li>
	<li>למקם את שתי האונות בצד שהיה מכריתת והדבק האונה כל לבמה של vibratome.</li>
	<li>לחתוך 200-300 סעיפים מיקרומטר בעובי של האזור מלא עניין. במקרה של ההיפוקמפוס, כ 3-4 פרוסות לכל האונה צריכה להתקבל.</li>
	<li>באמצעות פיפטה פלסטיק של פסטר, להעביר את הפרוסות אל. התא שקועים מחומצן (95% או 2, 5% CO 2) חנה המבר. לשמור על 34 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות 
	הערה: הטיפול של פרוסות עם סוכנים תרופתי פעיל, כגון חומרים Dkk1, ניתן לבצע בשלב זה על-ידי הוספת הסוכנים לתא פרוסה.</li>
	<li>להסיר את הפרוסות מן החדר באמצעות מברשת, למקם אותם לתוך צלחת 24-ובכן, תקן עבור 20 דקות ל- 1 h ב- 4% paraformaldehyde (סוכרוז PFA)/4% בטמפרטורת החדר (RT). 
	התראה: PFA רעיל, ללבוש הגנה הולמת.</li>
	<li>לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- X 1 PBS (10 דקות כל אחד). 
	הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן 1-2 ימים, כל עוד הפרוסות נשמרים ב 4 ° C ב- 1 X PBS-</li>
</ol> 2. Immunofluorescence עבור סמני סינפטית הערה: ניתן למצוא את המתכונים של כל מאגרי להשתמש בטבלה מס ' 2-
<ol><li>להחליף את PBS עם מאגר חוסם/permeabilizing (טבלה 2) הבארות פרוסה, דגירה-RT עבור 4-6 ח'</li>
	<li>לדלל הנוגדן שפן polyclonal נגד vGlut1-1:2,000 לדילול במאגר חוסם/permeabilization. 
	הערה: vGlut1 הוא סמן קדם סינפטיים הדמיית מסוף סינאפסות. עבור זיהוי סינפסה סינאפסות הפוסט-סינפטית, להשתמש עם נוגדנים polyclonal נגד PSD-95, שבערך שתדללו הפתרון אותו. השתמש נפח מינימלי של 300 µL כל טוב. כדי לזהות את המיקום האנטומי של ההיפוקמפוס, השתמש נוגדן זה ניתן לזהות את מבנה עצביים, כגון MAP2 או טובולין. לסדר את ריכוזי הנכון לכל הנוגדנים העיקרי עבור הסמנים סינפטית של בחירה (קדם, הפוסט-סינפטית) ורכים במאגר טריים חוסם/permeabilizing.</li>
	<li>דגירה הפרוסות בפתרון נוגדן ראשוני למשך הלילה (או 1-2 ימים) ב-4 ° C. שימוש פלטפורמה חזק עם תנועה נמרצת.</li>
	<li>לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS (10 דקות כל אחד).</li>
	<li>לדלל את שבערך נוגדנים משניים המתאימים במאגר חסימה. לדוגמה, בעת השימוש הנוגדן שפן vGlut1, להחיל נוגדנים משניים מזהה את הרכיב שפן (למשל, החמור אנטי-guinea-חזיר) מצומדת כדי fluorophore ספציפיים. בעת השימוש הנוגדן ארנב PSD-95, החל נוגדנים משניים מזהה את הרכיב הארנב (למשל, החמור נגד הארנב) מצומדת כדי fluorophore ספציפיים שונים.</li>
	<li>דגירה הפרוסות בפתרון זה עבור 2-3 h-ודא RT. כי הפרוסות מוגנים מפני האור, כמו נוגדנים משניים הם רגיש אור.</li>
	<li>לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS (10 דקות כל אחד).</li>
	<li>בזהירות להסיר את הפרוסות מהצלחת 24-ובכן שימוש במכחול ולמקם אותם באופן שווה על גבי מדרון זכוכית עם תוויות ברורות מראש. להוסיף טיפה של הרכבה בינונית מעל כל פרוסה ולאחר מכן מקם בעדינות coverslip זכוכית מעל הפרוסות. למנוע היווצרות של בועות אוויר. שמור לשימוש מספיק הרכבה בינונית (300-400 µL), כמו כמות לא מספקת עלולה להוביל לייבש פרוסות.</li>
	<li>השאירו יבש למשך תקופה מינימלית של 1-2 ימים ב- RT ולשמור את השקופיות מוגן מפני אור.</li>
	<li>לאחסן את השקופיות ב 4 ° C בטווח הקצר, אבל לאחסון לטווח ארוך, לשמור אותם ב-20 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 3. ייבוא תמונות וניתוח קונאפוקלית <ol><li>הדמיה באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.
	<ol><li>לזהות את האזור של ההיפוקמפוס לדימות (למשל, ammonis cornu 1 ו- 3 (CA1, CA3) או הפיתול משוננת (ג'י)) באמצעות 10 x או 20 x המטרה.</li>
		המטרה שמן-טבילה <li>שינוי סימן x 40 או 63 x כדי לוודא האנטומיה פרוסה לא נפגע על-ידי זיהוי רציפה neurites ומאורגן מבנה. להשתמש את סמן עצביים, כגון MAP2, כהפניה ( איור 1 א').</li>
		<li>לאחר מכן לעבור 60 x שמן-טבילה אובייקטיבי (NA = ~1.3 - 1.4) והתאם את ההגדרות לכל ערוץ כדי להשיג אופטימלי איתות והחדות. להגדיר את עוצמת הלייזר כל כדי למנוע את הרוויה של פיקסלים באמצעות אפשרות גבוהה- / עם ניגודיות נמוכה. 
		הערה: אלה ההגדרה תלויה המיקרוסקופ משמש, אלא להפנות הטבלה של חומרים הגדרות צריכת החשמל הלייזר בשימוש איור 2, איור 3, ו- איור 4. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש ברזולוציה 1024 x 1024 פיקסלים. ההגדרות צריכים להישאר קבועה לאורך כל תנאי אחר אותו ניסוי. יכול להיות מיושם זום נוספים אם יש צורך.</li>
		<li>להעריך את עומק ההכתמה איפה אפילו ולרכוש אוספי תמונות לפחות 8 קו מקביל (250 ננומטר) מטוסים. אז קח 3 ערימות סמוכים להחליפן בתמונות מאותו עניין לחתיכה. 
		הערה: העומק עשוי להשתנות מפרוסה אחת לאחרת, אבל תמיד צריך להיות כ- 2-5 מיקרומטר מפני השטח של הפרוסה.</li>
		<li>חוזר הרכישה לפחות 3 פרוסות לכל תנאי, מבעלי 6-8 לכל קבוצה הטיפול.</li>
	</ol></li> <li>ניתוח תמונה. 
	הערה: השתמש תוכנה ניתוח תמונה אוטומטית (ראה את הטבלה של חומרים). שימו לב כי חלק ממערכות דורשים רישיון, ואילו אחרים הם חינם, כגון ImageJ. התוכנה ששימשה יש לנתח את התמונות ב- 3D תוך התחשבות כל המטוסים של המחסנית עם תמונה. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים של התוכנה ששימשה בניתוח התמונה ( איור 1).
	<ol><li>שימוש מותאם אישית המבוסס על עוצמת סף פרוטוקול כדי לזהות כל puncta סינפטית של סמנים עצביים, אשר באופן ידני אופטימיזציה ו נבחר בתוך התוכנה [ראה את הטבלה של חומרים עבור התוכנה ספציפיים השתמשו בזה פרוטוקול]. 
		הערה: התוכנה מזהה את עוצמת מינימום ומקסימום עבור כל fluorophore ומשייך אחוז של העוצמה עבור כל אובייקט מוכר. שימו לב: האחוז של עוצמת ישתנה בהתאם fluorophore להשתמש, הנוגדן נגד דה מרקר סינפטית.</li>
		<li>עבור סמני סינפטית, ודא כי גודל מסננים (&#62; 0.1µm 3, &#60; 0.8µm 3) נבחרים בתוך התוכנה ו להחיל על התמונה. כוונן את הפרמטרים כדי להבטיח האובייקטים שנבחרו לא חופפות. לא לכלול כל אובייקט גדול מדי או קטן מדי כדי להיחשב puncta סינפטית (ראה איור 2B). 
		הערה: לאחר אופטימיזציה, ערכי סף זהים יוחלו על כל התמונות בתוך ניסוי נתון.</li>
		<li>לכמת את המספר אומר בעוצמה, נפח של הפרט puncta סינפטית (קדם או הפוסט-סינפטית) באמצעות פרוטוקולים הסף ממוטבת נבחר בתוך התוכנה. לנרמל את מספר puncta לנפח של שדה התמונה (בערך 16,928 מיקרומטר 3 במערכת המשמש כאן). לנרמל את העוצמה puncta סינפטית ללחץ של דה מרקר עצביים הפניה. 
		הערה: הסינפסות מוגדרים לוקליזציה שיתוף בין סמנים מראש והן הפוסט-סינפטית. פעם הסף פרוטוקולים עבור h puncta מראש, הפוסט-סינפטיתave כבר הוקמה, התוכנה עליך לזהות לוקליזציה משותף של puncta סינפטית כמו החפיפה של 1 פיקסל או יותר מטוס בודד. 
		הערה: עבור ניתוח סטטיסטי, לאשר כי כל הערכות של דגימות בצע נורמליות והומוגניות השונות, כפי שנקבע על-ידי Lilliefords במבחני χ2, בהתאמה. צריך להיות מנותח דגימות מראה של התפלגות נורמלית והומוגניות השונות עם בדיקות פרמטרית, כמתואר להלן. לדוגמה, ניתוח puncta סינפטית סינאפסות צריכה להתבצע באמצעות חד-כיווני אנובה עם חסימת ושכפול. ניסוי בודדות צריך להיחשב בלוק; בדרך כלל, ישנם 3 ניסויים עצמאי, כל אחד עם 1-3 עכברים מן כל תנאי-</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> איור 1: ניתוח של puncta סינפטית באמצעות ניתוח תמונה תוכנת. (א) צילום מסך של עוצמת סף פרוטוקול ההתאמה האישית. הדוגמה בהתחשב מיועד PSD-95, שבה puncta שנבחר יש גודל מוגדר של &#62; מיקרומטר 0.1 3 ו &#60; 0.8 מיקרומטר 3 ו נוכח ממוזער לאובייקטים חופפים. שימו לב כי התמונה המוצגת עבור מטוס קונאפוקלית אחד לאפשר את החזיית קל יותר puncta סינפטית ומבחר פרמטר מדויק. צילום מסך של ניתוח פלט מתוך התוכנה (בעקבות הבחירה של פרוטוקול ממוטב) (B). דוגמה של raw puncta סינפטית מספר מדידות בהתבסס על הכמות. ערכים אלה מיוצאים ואז תוכנת הגיליון האלקטרוני. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> איור 2: בדיקת איכות של ההגדרות פרוסה של פרמטר עבור סינפטית puncta. (א) נציג קונאפוקלית תמונות (40 x המטרה) באזור עניין: CA1 שכבה radiatum (sr) של הרובד oriens (כך) על נתח בהיפוקמפוס מזוהים על-ידי MAP2 מכתים. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. (B) קונאפוקלית תמונות (60 x אובייקטיבית, 1.3 נוספים של X הגדלה על התוכנה רכישה) של radiatum הרובד CA1, עם סמנים סינאפסות-(ירוק) vGlut1 ו- PSD-95 (אדום)-מ פרוסות בהיפוקמפוס. הערה הזיהוי של puncta ברור מראש, פוסט-סינפטיים. Puncta גדול יותר מיקרומטר 0.8 3 אינם נכללים כימות (החצים הלבנים). סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר (ג) Confocal תמונות (60 x אובייקטיבית, 1.3 נוספים של X הגדלה על התוכנה רכישה) של radiatum הרובד CA1, עם סמנים סינאפסות-vGlut1 (ירוק)-ממקטעים בהיפוקמפוס cryostat-גזור מן המוח כולו קבוע בכדורגלן. הערה על הימצאות חורים גדולים והוא vGlut1 לא סדיר, גושית מכתים. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<ol>
	<li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+and+LTD:+an+embarrassment+of+riches.">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li><li>Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+degeneration+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li><li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+cell+adhesion.">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).</li><li>Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+an+excitatory+synapse.">The architecture of an excitatory synapse.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).</li><li>Dobie, F. A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synapse+dynamics:+coordinated+presynaptic+and+postsynaptic+mobility+and+the+major+contribution+of+recycled+vesicles+to+new+synapse+formation.">Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation.</a> J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).</li><li>Jackson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tau+increases+amyloid+beta+plaque+size+but+not+amyloid+beta-mediated+synapse+loss+in+a+novel+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease.</a> Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).</li><li>Heck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+3D+detection+of+synaptic+contacts+reveals+the+formation+of+cortico-striatal+synapses+upon+cocaine+treatment+in+vivo.">A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).</li><li>Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+levels+of+PSD95+and+two+associated+proteins+and+increased+levels+of+BCl2+and+caspase+3+in+hippocampus+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+Insights+into+their+potential+roles+for+loss+of+synapses+and+memory,+accumulation+of+Abeta,+and+neurodegeneration+in+a+prodromal+stage+of+Alzheimer's+disease.">Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).</li><li>Harwell, C. S., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptophysin+depletion+and+intraneuronal+Abeta+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+from+huAPP+transgenic+mice.">Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).</li><li>Marzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+Synapse+Degeneration+by+Restoring+Wnt+Signaling+in+the+Adult+Hippocampus.">Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus.</a> Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).</li><li>Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+autism+and+intellectual+disabilities.">Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).</li><li>Janezic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+dopaminergic+transmission+precede+neuron+loss+and+dysfunction+in+a+new+Parkinson+model.">Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).</li><li>Caricasole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Dickkopf-1,+a+negative+modulator+of+the+Wnt+pathway,+is+associated+with+neuronal+degeneration+in+Alzheimer's+brain.">Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain.</a> J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).</li><li>De Ferrari, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+genetic+variation+within+the+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+6+and+late-onset+Alzheimer's+disease.">Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).</li><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+LRP6-mediated+Wnt+signaling+contributes+to+synaptic+abnormalities+and+amyloid+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).</li><li>Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Secreted+Wnt+Antagonist+Dickkopf-1+Is+Required+for+Amyloid+beta-Mediated+Synaptic+Loss.">The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss.</a> J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).</li><li>Rosi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Dickkopf-1+expression+in+transgenic+mouse+models+of+neurodegenerative+disease.">Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease.</a> J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).</li><li>Budnik, V., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+synaptic+development+and+plasticity.">Wnt signaling during synaptic development and plasticity.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).</li><li>Ciani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+tunes+neurotransmitter+release+by+directly+targeting+Synaptotagmin-1.">Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1.</a> Nat Commun. 6, 8302 (2015).</li><li>Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+in+action:+from+synapse+formation+to+synaptic+maintenance.">Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance.</a> Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).</li><li>Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development.">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li><li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice.">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הערכת סינפסה מספר מדויק חיוני בתחום מדעי המוח. כאן, אנו מראים כיצד להעריך את הצפיפות של סינפסות האזור radiatum CA1 שכבה של פרוסות בהיפוקמפוס כמערכת מודל. המשמעות לגבי שיטות קיימות מומחש במאמר מחקר האחרונות שלנו על ההשפעה של מחסור ונ ט בהיפוקמפוס, שבו אנו גם מוערכים סינפסה מספר EM יחיד-סעיף10. סדר הגודל של אובדן סינפסה דומים בין יחיד-סעיף EM פרוסות המוח של השיטה המתוארת כאן10. לפיכך, ממצא זה מדגים את הדיוק והאמינות של הטכניקה.
חשוב, מגבלה של יחיד-סעיף EM והן immunostaining הסינפסות, כפי שהוצג כאן, היא חוסר היכולת לאמוד במדויק את מספר סינפסה מוחלטת עבור אזור מסוים במוח. אכן, חשוב לזהות שינויים מורפולוגיים הכללית, כפי שינויי הנפח הכולל יכול להשפיע מספר סינפטית. מגבלה נוספת היא כי נוגדנים מסוימים הם פחות יעילים צביעת אזורים במוח ללא פגע, חלקית עקב הצפיפות הקיצונית של קשרים סינפטיים. שחווינו באיכות גבוהה יותר כתמים של vGlut1, gephyrin באמצעות זו פרוסה והכנה קיבוע PFA עוקבות לכל היותר 1 h, לעומת הקיבעון מיידית של המוח כולו בכדורגלן (איור 2C). האחרון הובילו גושית סינפטית מכתים, עם חורים ברקמה. למרות זאת, החדירה נוגדן vGlut1 הוא עדיין מוגבל בשתי השיטות (כמה עשרות מיקרונים). אנחנו לא להתגבר על מגבלה זו, אפילו עם נוגדן מוגברת דגירה, אבל מתן החדירה נוגדן הוא גדול יותר עומק סה כ זה הוא עם תמונה, צריכה להיות כל השפעה על התוצאה הסופית. יתר על כן, טיפול מיוחד יש לנקוט על מנת להבטיח כי ההכתמה אפילו במהלך רכשה הערימה כולה.
במחקר שלנו, רצינו להבחין סינאפסות בין הסינפסות מעכבות. כתוצאה מכך, בחרנו vGlut1/PSD-95 ו- vGAT/gephyrin, בהתאמה, כפי חלבונים אלה באים לידי ביטוי מאוד בהיפוקמפוס עכבר מבוגרים והם ספציפיים עבור כל סוג של סינפסה4,5. סמנים אחרים סינפטית סינאפסות יכול השתמשו כדי לזהות כל סינפסה המתאימים, כגון קולטנים מועשר ב כל סינפסה, כולל קולטני NMDA, אמפא סינאפסות, קולטני GABAA הסינפסות מעכבות. גם להיות מזוהה עם פרוטוקול שלנו, ולהבטיח כי נוגדנים ספציפיים זמינים, כפי שמוצג עבור וכולינרגיים הסינפסות סטריאטום22נוירוטרנסמיטרים או neuromodulators אחרים. בנוסף, הפחתת עובי כל פרוסה 120 מיקרומטר יכול חלקית להתגבר על כמות נמוכה של דגימות שהושג עם פרוסות חריפה, אשר הכרחי ללימודי מוח קטן מבנים כגון האמיגדלה.
ניתן ליישום יישומים עתידיים של פרוטוקול שלנו במחקר של אזורים שונים במוח והפרעות. לדוגמה, ב- סטריאטום (אזור של המוח הקשורים עם מחלת פרקינסון), שילוב של vGlut2/PSD-95 או vGlut1/PSD-95 יכול לשמש כדי להבדיל בין הסינפסות סינאפסות מ afferents מגיע קליפת או התלמוס, בהתאמה22.
לסיכום, אנחנו הראו שיטה אמינה כדי לבדוק את המספר של הסינפסות ברקמות המוח באמצעות סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים להגדרת סינפסה. שלבים קריטיים כוללות הכנת פרוסות בהיפוקמפוס טוב, זמן קיבעון של עד 1 h מחברים, היישום של מדיום מספיק הרכבה, השימוש של נוגדנים אמין, הגדרות רכישת תמונה המתאימה, וזיהוי מחמירים puncta סינפטית. בסופו של דבר, בשיטה זו הוא מהיר יחסית והוא לשחזור בקלות על ידי כל מעבדות יש גישה מיקרוסקופ קונפוקלי.

המוח האנושי מורכב כ 1014 הסינפסות. סינפסה מספר מוסדר בחוזקה במהלך ההתפתחות וההתבגרות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). במהלך פיתוח, סינפסה מספר הוא מווסת על ידי synaptogenesis וגיזום כדי ליצור רשתות עצביים פונקציונלי. למידה וזיכרון נתמכים על ידי ויסות סינפסה מספר כוח, תהליך המכונה potentiation סינפטית, דיכאון1. חשוב, הייצוב של הסינפסות בוגר הוא חיוני לשמירה על חיבורי הרשת העצבית. יתר על כן, גירעונות בצפיפות סינפסה דווחו כבר בשלבים מוקדמים של התנאים ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD)2. לכן, היכולת לזהות ולהעריך במדויק מספר סינפסה הוא היסוד ההערכה של המוח פיזיולוגיה פתולוגיה.
צפיפות קיצונית והטבע קומפקטי של הסינפסות להגיע מאתגר כדי להעריך את המספר המדויק שלהם באזורים במוח ללא פגע שני נוירונים בתמורה קרוב, מופרדים על-ידי שסוע סינפטית3עשויים כימי סינפסות מערכת העצבים. מסוף סינפטית מראש, או בוטון סינפטית, מגיח האקסון והיא מורכבת שלפוחית שהצטברו, המכילים נוירוטרנסמיטורים המגדירים יחודיות של סינפסה — כלומר, גלוטמט וגאמא אמינו בוטירית (GABA) עבור סינאפסות, מעכבות synapses, בהתאמה. הקרומים של השלפוחיות המוגלתיות מכילים ספיציפית כל עצבי vesicular מובילים: vesicular גלוטמט טרנספורטר (vGlut) עבור גלוטמט וטרנספורטר גאבא vesicular (vGAT) עבור GABA. הטרמינל הפוסט-סינפטית היא מבנה צפופה מורכב של חלבונים מרובות, כולל רצפטורים, מולקולות אדהזיה חלבונים לגרדום. הסינפסות סינאפסות, חלבונים צפיפות-95 פוסט-סינפטיים (PSD-95) הוא הנפוץ ביותר לגרדום חלבון4, להתכוונן סינאפסות N-methyl-D-aspartate(NMDA-), חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (נולד באמפא) קולטן לפעול, ואילו gephyrin עוגנים קולטנים מעכבות5מעכבות הפוסט-סינפטית מסוף. בסך הכל, יחודיות של חלבונים תאים טרום, פוסט-סינפטיים הסיוע בידול, זיהוי של סוגי סינפסה.
ניתן לבצע הערכת מספר סינפסה עם טכניקות שונות. הנפוץ ביותר הוא השימוש של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), המאפשרת הניתוח של הסינפסה באזורי המוח קומפקטי ללא פגע ועם בהגדלה ברזולוציה. עם זאת, טכניקה זו יקר מאוד, מחייב הכנת הדוגמא מסובך, זמן רב מאוד. טכניקות אחרות כוללות את השימוש במערך טומוגרפיה6, שבו יש חיסרון גדול בכך שהיא דורשת ציוד מיוחדים ויקרים כדי לבצע את הניתוח. יתר על כן, קווים הטרנסגניים לבטא מסוימות סינפטיים סמנים שימושיים-הערכת סינפסה מספר7, אבל הדור של שורות חדשות יכול להיות מגבילים ויקרות, ביטוי של חלבונים עלול לגרום לא רצויים את המטרה פנוטיפים.
בשל מגבלות אלה, פשטות, חוקרים רבים להעריך מספר סינפסה על-ידי בדיקת רמות חלבונים סינפטיים הכולל. עם זאת, אובדן סינפסה יכול להיות שנצפו לפני שינויים משמעותיים חלבון, כתוצאות שיפוץ מבניות סינפטית במהלך פיזור תמורה מראש או הפוסט-סינפטית, עם אין השפלה של חלבונים סינפטיים. יתר על כן, במודעה, רמות חלבונים סינפטיים הן ניוון סינפסה הבאים מופחתת או מוות עצביים8,9. כימות של רמות הכולל אינו מאפשר הבחנה זו. לפיכך, יש צורך לפתח שיטה מדויקת, נגיש ואמין על ההערכה של מספר סינפסה במוח.
במאמר זה, אנו מתארים כיצד לזהות ולקבוע את המספר של הסינפסות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס ביסודיות. הסינפסות מוגדרים על-ידי colocalization של סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים המופיעים הפצה punctate. נדגים את תוקפו של טכניקה זו דרך המחקר של חגיגת איתות במוח. Wnts הם חלבונים המופרש חשוב עבור צורה, חיסול, תחזוקה של הסינפסות. אין ויוו אינדוקציה של אנטגוניסט המופרש של המפל ונ ט, Dickkopf-1 (Dkk1), מוביל לירידה סינפטית סינאפסות תוך שמירה על סינפסות מעכבות ההיפוקמפוס10. אנחנו להמחיש את זיהוי וספירה של סינאפסות סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות העכבר למבוגרים לבטא Dkk1 וסמן את transferability של טכניקה זו לסוגים אחרים של רקמות/תרבות ההכנות.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5905</td><td>vGlut1 (1:2000)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-046</td><td>PSD-95 (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 004</td><td>vGAT (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>147011</td><td>Gephyrin (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>MAP2 (1:10000)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson Laboratories</td><td>706-545-148</td><td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>SouthernBiotech</td><td>00-4958-02</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>PerkinElmer</td><td>NA</td><td>Volocity</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>203</td><td>No 11</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>1446875</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BOC</td><td>NA</td><td>Cylinder</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo</td><td>7107</td><td>08-1.0mm thick</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>iDkk1 mice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&amp;alpha; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&amp;alpha; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for solutions:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Millipore</td><td>S30-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

הסינפסות במוח, הם צמתי מיוחדים בין נוירונים, הקובע את הכוח ואת התפשטות אותות עצביים. המספר של הסינפסות מוסדר בחוזקה במהלך ההתפתחות וההתבגרות עצביים. חשוב לציין, גירעונות במספר סינפסה יכול להוביל בתפקוד הקוגניטיבי. לכן, הערכת מספר סינפסה היא חלק אינטגרלי של הנוירו-ביולוגיה. עם זאת, כפי הסינפסות קטן וקומפקטי במיוחד במוח שלם, ההערכה של המספר המוחלט הוא מאתגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה בקלות לזהות ולהעריך סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות מכרסמים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. הוא כולל הליך שלושה שלבים כדי להעריך את הסינפסות בתמונות באיכות גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית על-ידי ניתוח לוקליזציה שיתוף של חלבונים קדם ו postsynaptic בפרוסות בהיפוקמפוס. זה גם מסביר איך הניתוח מבוצע ונותן דוגמאות מייצגות של הסינפסות סינאפסות והן מעכבות. פרוטוקול זה מספק בסיס מוצק לניתוח של הסינפסות, ניתן להחיל על כל מחקר חוקר את המבנה והתפקוד של המוח.

סינפסה אובדן מתרחשת בשלב מוקדם של מחלות ניווניות כגון AD ו מחלת פרקינסון2,11,12. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס גירעונות אלה נשארים ממעטים להבין. ליקויים ונ ט איתות קושרו עם AD13,14,15,16,17. Wnts glycoproteins המופרש, לשחק תפקיד חיוני סינפסה היווצרות של אפנון הסינאפסית18,19,20,21. לאחרונה, אנחנו מזוהות Wnts מפתח סמביוזה סינפטית תחזוקת מערכת העצבים בוגרת10,22. לחקור באופן מדויק את ההשפעה של חגיגת איתות על סינפסות ההיפוקמפוס של עכברים מהונדסים, לקחנו יתרון של המוח פרוסה הכנה ו מיקרוסקופיה קונפוקלית להעריך את השינויים במספר סינפסה. זיהינו פרוסות בריא שבו המבנה היה נשמר (איור 2 א). יתר על כן, הבחירה של puncta סינפטית בקפידה הוגדרה, בדחיקת אובייקטים מוכתם גדולים כנראה המייצג מצטברים חלבונים (איור 2B). קריטריון זה הוחל על כל התמונות, עם הפרמטרים באותו ניתוח קפדני.
השתמשנו מערכת מודל הטרנסגניים שגורם הביטוי של אנטגוניסט ונ ט Dkk1 מופרשים למבוגרים עכברים (iDkk1) תחת טטרציקלין לשלוט (ראה הטבלה של חומרים)10,22. להדגים כי המצור על חגיגת איתות בהיפוקמפוס למבוגרים מפעיל סינפסה סינאפסות אובדן במיוחד באזור CA1 שכבה radiatum (איור 3). איור 3A מדגים להחליפן בתמונות קונאפוקלית של סינאפסות סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים (vGlut1 ו- PSD-95, בהתאמה) שנרכש בהיפוקמפוס פרוסות של עכברים iDkk1 לבטא Dkk1 שבועיים, כמו גם הפקדים המתאימים שלהם. אנו ניתח את התמונות האלה באמצעות תוכנת Volocity, הדגימו הפחתה משמעותית במספר של הסינפסות סינאפסות, לכמת על ידי לוקליזציה משותף של vGlut1 ו- PSD-95-שכותרתו puncta באזור CA1 ההיפוקמפוס של עכברים iDkk1 בעקבות אינדוקציה של Dkk1 במשך שבועיים (איור 3B, * p &#60; 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 6 עכברים לכל גנוטיפ). ב- radiatum הרובד CA1, צומצם המספר puncta סינפסה סינאפסות לכל מיקרומטר 1,0003 בין 500 בעכברים שליטה ל-300 בעכברים iDkk1. לעומת זאת, ביטוי Dkk1 מושרה לא השפיע על המספר של הסינפסות מעכבות (המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים vGAT gephyrin, בהתאמה), כפי שמוצג באיור 4A-B (p &#62; 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 3 עכברים לכל גנוטיפ).
חשוב לנו לבצע ניתוח עוצמה סטטיסטית כדי להעריך מספר מתאים של פרוסות וחיות הנדרש להפקת תוצאות חזקות אלו. באמצעות R, אנו מחושב כ 35 פרוסות לכל תנאי היו נחוצים (3 תמונות x 3 פרוסות x 6 חיות = 36) כדי לזהות גודל האפקט גדול (f = 0.4) עם 80% ביטחון (כוח = 0.8) אנובה בכיוון אחד עם חסימת ושכפול, כפי שמתואר בשלב 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
איור 3: אובדן של סינאפסות סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות עכברים iDkk1. (א) נציג תמונות קונאפוקלית של CA1 שכבה radiatum הצג סינאפסות הסינפסות, המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין vGlut1 ל- PSD-95 (החצים הלבנים). החלונית התחתונה מייצג של הגדלה גבוהה יותר של המלבן המסומן. גודל ברים = 2 מיקרומטר. (B) האחוז של סינאפסות הסינפסות בין שליטה iDkk1 הייתה לכמת באמצעות תוכנה המוזכרים בטבלה של חומרים (* p &#60; 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 6 עכברים לכל גנוטיפ). הנתונים הם מייצגים ± ב- SEM... איור זה השתנה בין התייחסות10. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
איור 4: הסינפסות מעכבות הם ללא שינוי בפרוסות בהיפוקמפוס של עכברים iDkk1. (א) נציג תמונות קונאפוקלית של radiatum הרובד CA1 של הסינפסות מעכבות המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין vGAT לבין gephyrin (החצים הלבנים). החלונית התחתונה מייצג של הגדלה גבוהה יותר של המלבן המסומן. גודל ברים = 2 מיקרומטר. (B) אחוז מעכבות הסינפסות בין עכברים iDkk1 ובקרה, כפי לכמת באמצעות תוכנת Volocity (p &#62; 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 3 עכברים לכל גנוטיפ). הנתונים הם מייצגים ± ב- SEM... איור זה השתנה בין התייחסות10. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>סוכרוז גבוהה חנה המבר רכיבים</td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>הערות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>2.5 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2PO NaH4, 2 H2O</td>
			<td>1.25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>חומצה Kynurenic</td>
			<td>1.25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פירובט</td>
			<td>2 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.1 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 מ מ</td>
			<td>להוסיף לאחר חמצון של פתרון</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 מ מ</td>
			<td>להוסיף לאחר חמצון של פתרון</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-גלוקוז</td>
			<td>25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סוכרוז</td>
			<td>100 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תא המשוקע רכיבים כלנית חדד</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>2.5 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2PO NaH4, 2 H2O</td>
			<td>1.25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 מ מ</td>
			<td>להוסיף לאחר חמצון של פתרון</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 מ מ</td>
			<td>להוסיף לאחר חמצון של פתרון</td>
		
		<tr>
			<td>D-גלוקוז</td>
			<td>25 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
	

טבלה 1: חנה המבר ההרכב.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מאגר חוסם/permeabilizing</td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>הערות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סרום חמור</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>טריטון-X</td>
			<td>0.50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>ה-pH ל 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1.37 מטר</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC.</td>
			<td>27 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2PO NaH4</td>
			<td>100 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2פו ח'4</td>
			<td>18 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% סוכרוז PFA/4%</td>
			<td></td>
			<td>ה-pH ל 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>לדלל מ 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>כדורגלן</td>
			<td>1.33 מ'</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סוכרוז</td>
			<td>117 מ מ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: מאגרים המשמשים immunofluorescent מכתים.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices at JoVE.com

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K Views.  University College London. נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

Video: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Biochemistry

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56153/evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices'>Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).</a>This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic architecture through their colocalization.

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for ...