Name: purification of the membrane compartment for endoplasmic reticulum-associated degradation of exogenous antigens in cross-presentation
Uploaded: 2017-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסאקי של בריאות ורווחה.

1. גידול תאים, תוספת של אנטיגנים אקסוגני <ol><li>הכן בווה באמצעות תיוג של ביוטין-חלבון קיט בעקבות היצרן &#39; פרוטוקול s. 
	הערה: בדרך כלל, בווה מכיל 2 מ' ביוטין לכל ביצית 1 מ' בממוצע-</li>
	<li>DC2.4 לגדל תאים RPMI-1640 בתוספת 2 מ מגלוטמין 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ, פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, 55 מ"מ מרקפטואתנול, 10 מ מ HEPES (pH 7.5), סרום עגל עוברית 10% (להלן RPMI) ב 37 ° C 5 % CO 2 ב חממה humidified (להלן ללא אזכור, תאים מודגרת ב מצב זה). אפשרי גם להשתמש בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 3.7 g/L NaHCO 3 (להלן DMEM) במקום RPMI DMEM.</li>
	<li>ביום אחד לפני טיהור, פצל את התאים RPMI עונה 1 פרק 10 5 תאים/מ בצלחת תרביות רקמה. הימנע להשאיר את התאים במצב confluent. תאים DC2.4 יכול מאוד לשלב אנטיגנים אקסוגני עד מדינה confluent למחצה, אבל במהירות מאבדים את היכולת כשמגיעים למצב של יתר confluent.</li>
	תאים <li>לפני DC2.4 הם confluent למחצה, להוסיף µg/mL 250 של בווה עבור 1 x 10 6 תאים למ"ל, תקופת דגירה של 2-4 ה 
	הערה: במהלך הניסויים במורד הזרם, כל מאגרי, ריאגנטים נשמרים ב 4 ° C אלא אם צוין אחרת.</li>
</ol> 2. הכנת Microsomes <ol><li>לקצור את התאים DC2.4 על ידי pipetting עדין מהצלחת רקמה לתוך צינור חרוטי 50 מ ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות, 4 ° C בזהירות להסיר את המדיום עם בווה על-ידי שאיפה.</li>
	<li>לרחוץ את התאים DC2.4 פעמיים עם 40 מ של מאגר PBS (1.37 מ מ NaCl, 8.1 מ מ נה 2 HPO 4, 2.68 מ מ אשלגן כלורי, 2 PO 1.47 אינץ מ מ ח' 4) על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות, 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי שאיפה.</li>
	<li>Resuspend בגדר בשלב 2.3 ב- 1 - 2 מ ל (כרך 1/20-1/10 של תרבות בינוני) המגון בינוני (0.25 M סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 10 מ מ HEPES-NaOH [pH 7.4]) עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז והעברה DC2.4 resuspended תאים לתוך מהמגן דאונס קר כקרח.</li>
	<li>לשבש את התאים DC2.4 resuspended בעדינות על ידי 10-20 משיחות עם מהמגן דאונס קר כקרח. 
	הערה: במהלך השלב שיבושים, מהמגן דאונס הוא מקורר על קרח</li>
	<li>להעביר את המתלים שיבשו תא צינור חרוטי 15 mL-</li>
	<li>להוסיף 8-9 מ ל המגון בינוני הכולל 10 מ"ל, centrifuge את הצינור חרוט 10 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור חרוטי 15-mL החדש כדי להסיר תאים רצופה, גרעינים, centrifuge את צינור חרוטי שוב 10 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור ultracentrifugation חדש צנטריפוגה למשך 45 דקות ב 100,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בקפידה תוך 1-2 מ של המגון בינוני עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז מאת pipetting הפתרון לאורך מספר פעמים כדי להפוך שבר microsome לניסויים במורד הזרם.</li>
	<li>להעביר את השבר microsome לתוך צינור התחתון עגול 5-mL- 
	הערה: לאחר שלב זה, זה אפשרי להעשיר microsomes אובייקטיבי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות iodixanol על פי היצרן &#39; פרוטוקול s, כדי להסיר את microsomes שאינם ספציפיים. שברים שיא אנטיגנים אקסוגני של נאספים וכוח נתון אז השלב הבא של טיהור (שלב 3).</li>
</ol> 3. טיהור של Microsomes עם בווה עירד שעברו <ol><li>נפח הוסף 1/100 מערכו של טרי חרוזים SA-מגנטי כדי השבר microsome של צעד 2.11 ב 5 mL סיבוב התחתית התחתונה. 
	הערה: לפני שלב זה, זה אפשרי לנקות את השבר microsome מראש על ידי חרוזים שליטה-מגנטי כדי להפחית את contaminations של microsomes שאינם ספציפיים.</li>
	<li>מערבבים היטב ובעדינות לסובב את הצינור התחתון עגול לאט במשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להוסיף 2-3 מ"ל של מדיום המגון הכולל 4 מ"ל לתוך הצינור התחתון עגול ומערבבים בעדינות היטב.</li>
	<li>למקם את הצינור התחתון עגול על דוכן מגנטי, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס. מאז החרוזים קשורה השלפוחיות המוגלתיות נמשכים למגנט, חום מיקרו-חרוזים יצטברו בהדרגה אל הקיר הצינור הקרוב למגנט.</li>
	<li>עם הצינור שנותרו הדוכן מגנטי, בזהירות למחוק את supernatants על ידי השאיפה להסיר את השלפוחיות המוגלתיות לא מאוגד.</li>
	<li>לשטוף החרוזים מגנטי קשורה השלפוחיות המוגלתיות פעמיים עם 5 מיליליטר המגון בינוני על ידי המגנטי לעמוד 10 דקות ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי השאיפה בזהירות. 
	הערה: ללא העמדה מגנטי, טיהור על ידי centrifugations ב g x 2,000 למשך 10 דקות, 4 ° C זמין גם.</li>
	<li>Resuspend החרוזים מגנטי קשורה השלפוחיות המוגלתיות היטב במדיום 100 µL המגון על-ידי pipetting הפתרון לאורך מספר פעמים.</li>
	<li>להעביר השלפוחיות המוגלתיות resuspended microtube חדשים כמו microsome מטוהרים לניסויים במורד הזרם. 
	הערה: בדרך כלל, 50 שבר microsome של µL, המכיל 5-20 חלבונים µg מתאי 7 עונה 1 פרק 10 ניתן לבודד.</li>
</ol> 4. ניתוח של Microsomes לטהר <ol><li>Resuspend המגנטי חרוזים מאוגדים השלפוחיות המוגלתיות מ 3.8 צעד 100-200 µL TNE מאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז במקום המדיום המגון.</li>
	<li>להעביר את lysate שלב 4.1 microtube החדש 1.5-mL-</li>
	<li>לקבוע ריכוז חלבון שלב 4.2 באמצעות ערכת assay BCA לכל היצרן &#39; פרוטוקול s. 
	הערה: בדרך כלל, 5-10 µL lysate מהשלב 4.2 מספיקה כדי לקבוע ריכוז חלבון.</li>
	<li>להעביר את lysate מהשלב 4.2 (2 µg של חלבון עבור צביעת כסף ו 10 µg של חלבון עבור סופג המערבי) לתוך חדש microtubes.</li>
	<li>לשים את microtubes על גוש חום-95 ° C ומרתיחים חלבונים 1 x מרחביות ג'ל-טעינת מאגר (100 מ מ טריס-HCl pH 6.8, 200 מ"מ dithiothreitol, 4% מרחביות, 0.2% bromophenol כחול, 20% גליצרול) עבור 5 דק</li>
	<li>Centrifuge את microtubes 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtubes חדש כדי להסיר את השברים לא מסיסים.</li>
	<li>לנתח את החלבונים נפתרה בשלב 4.6 (2 µg) מאת SD רגיל-דף.</li>
	<li>Visualize הלהקות חלבונים על ידי כסף מכתים באמצעות צביעת כסף קיט בעקבות היצרן &#39; פרוטוקול s.</li>
	<li>לנתח את החלבונים נפתרה בשלב 4.6 (10 µg) על ידי SD-דף רגיל סופג-מערבי. השתמש הכימית (SA-HRP) לכל היצרן &#39; s פרוטוקול והמחש מאת fluorography.</li>
</ol> 5. במבחנה בנייתו מחדש של עירד Ubiquitination של בווה באמצעות מטוהר Microsomes microsomes <ol><li>העברה מטוהרים (5-10 µg של חלבון) משלב 3.8 עם נפח 50% של רטיקולוציט lysate (RL), 1 x תגובת מאגר (50 מ מ טריס pH 7.4, 3 מ מ ATP, 0.5 מ מ MgCl 2), ו- 0-שתיים pM מתויג דגל אוביקוויטין ב microtube החדש. הנפח הסופי של הניסוי הזה הוא 20-40 µL.</li>
	<li>Incubate microtube עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. 
	הערה: אם כמות ubiquitinated בווה בשלב 5.12 הוא קטן מדי כדי לזהות סופג המערבי, להוסיף 10 מיקרומטר של MG132 או 2 מיקרומטר של lactacystin כדי לעכב את העיבוד של בווה ubiquitinated מאת proteasomes.</li>
	<li>לעצור את התגובה על ידי הצבת את microtube על קרח</li>
	<li>לפתור את microsomes על-ידי הוספת 500 מאגר TNE µL עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז.</li>
	<li>צנטריפוגה microtube 10 דקות ב- 21,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtube חדשים להסיר את השברים לא מסיסים, אשר מכילים בווה ubiquitinated ב DC2.4 לפני וזמינותו ubiquitination במבחנה.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע microtube חדש ולהוסיף 1/100 בכמויות החרוזים SA-מגנטי חדש (בדרך כלל 5 µL עבור 500 µL של supernatants).</li>
	<li>מערבבים היטב ובעדינות לסובב את microtube לאט לאט במשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>Centrifuge את microtube 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע על ידי השאיפה לשחזר את בווה ואת ubiquitinated בווה מאוגד עם החרוזים SA-מגנטית.</li>
	<li>לשטוף פעמיים את החרוזים SA-מגנטית שנאספו עם 1 מ"ל של מאגר TNE על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע בכל פעם על ידי שאיפה.</li>
	<li>להרתיח את החרוזים SA-מגנטית 1 x ג'ל מרחביות טעינת מאגר עבור 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס על חום-בלוק לפתור את החלבונים מטוהרת על-ידי החרוזים SA-מגנטית.</li>
	<li>Centrifuge את microtube 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtube חדשים להסיר את השברים לא מסיסים.</li>
	<li>לנתח את החרוזים SA-מגנטית חייבים את החלבונים על ידי עמודים SD סטנדרטי, לא סופג-מערבי. השימוש של נוגדנים (אנטי-דגל נגד-multi-Ub, העכבר אנטי איג-HRP) ו הכימית (SA-HRP) הוא לפי היצרן &#39; פרוטוקול s ודמיינו ידי fluorography.</li>
</ol>

<ol>
	<li>van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Providing+ligands+for+MHC+class+I+molecules.">Providing ligands for MHC class I molecules.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).</li><li>Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).</li><li>McDevitt, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+the+role+of+the+major+histocompatibility+complex+in+the+immune+response.">Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response.</a> Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).</li><li>Bedoui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation+of+viral+and+self+antigens+by+skin-derived+CD103++dendritic+cells.">Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells.</a> Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).</li><li>Segura, E., Villadangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+by+dendritic+cells+in+vivo.">Antigen presentation by dendritic cells in vivo.</a> Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).</li><li>Cheong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+stimulation+fully+differentiates+monocytes+to+DC-SIGN/CD209(+)+dendritic+cells+for+immune+T+cell+areas.">Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas.</a> Cell. 143 (3), 416-429 (2010).</li><li>Henri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD207++CD103++dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells.">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).</li><li>Shortman, K., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8++dendritic+cell+subset.">The CD8+ dendritic cell subset.</a> Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).</li><li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation:+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance.">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li><li>Nair-Gupta, P., Blander, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+view+of+the+intracellular+mechanisms+regulating+cross-presentation.">An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation.</a> Front Immunol. , (2013).</li><li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation+by+dendritic+cells.">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li><li>Kurts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo.">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).</li><li>Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I-restricted+cross-presentation+of+exogenous+self-antigens+leads+to+deletion+of+autoreactive+CD8(+)+T+cells.">Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells.</a> J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).</li><li>Bonifaz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+protein+antigen+to+the+dendritic+cell+receptor+DEC-205+in+the+steady+state+leads+to+antigen+presentation+on+major+histocompatibility+complex+class+I+products+and+peripheral+CD8++T+cell+tolerance.">Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance.</a> J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).</li><li>Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation+in+viral+immunity+and+self-tolerance.">Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance.</a> Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).</li><li>Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+antigens+are+processed+through+the+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+(ERAD)+in+cross-presentation+by+dendritic+cells.">Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells.</a> Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).</li><li>Houde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomes+are+competent+organelles+for+antigen+cross-presentation.">Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation.</a> Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).</li><li>Guermonprez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-phagosome+fusion+defines+an+MHC+class+I+cross-presentation+compartment+in+dendritic+cells.">ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells.</a> Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).</li><li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation.">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).</li><li>Liz&#233;e, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dendritic+cell+cross-presentation+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+cytoplasmic+domain.">Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain.</a> Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).</li><li>Basha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD74-dependent+MHC+class+I+endolysosomal+cross-presentation+pathway.">A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway.</a> Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).</li><li>Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity,+contradictions,+and+conundrums:+studying+post-proteasomal+proteolysis+in+HLA+class+I+antigen+presentation.">Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation.</a> Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).</li><li>Wiertz, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec61-mediated+transfer+of+a+membrane+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+proteasome+for+destruction.">Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction.</a> Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).</li><li>Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-associated+degradation+in+protein+quality+control+and+cellular+regulation.">ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).</li><li>Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-translocation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum+into+the+cytosol.">Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).</li><li>Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+targeting+and+translocation+of+proteins+to+the+endoplasmic+reticulum.">Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).</li><li>Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+homeostasis.">Mitochondrial protein homeostasis.</a> IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).</li><li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules.">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li><li>Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+subcellular+compartment+in+which+exogenous+antigens+undergo+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+from+dendritic+cells.">Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells.</a> Heliyon. , (2016).</li><li>Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phagosome-to-cytosol+pathway+for+exogenous+antigens+presented+on+MHC+class+I+molecules.">A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules.</a> Science. 267 (5195), 243-246 (1995).</li><li>Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+endoplasmic+reticulum+protein+retro+translocation+machinery+during+cross+presentation+by+dendritic+cells.">A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells.</a> Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).</li><li>Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tamp&#233;, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens.">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li><li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation.">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li><li>Zehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocon+protein+Sec61+mediates+antigen+transport+from+endosomes+in+the+cytosol+for+cross-presentation+to+CD8(+)+T+cells.">The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells.</a> Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקרים קודמים של CP, אנטיגנים אקסוגני incorporated שהצטברו באזור הסגור של אנדוזום מאוחר או מיון על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent16,30,31,32. ההערכה היא כי עירד כמו תחבורה, עיבוד של אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באזורים מיוחדים אלה של מיון או אנדוזום מאוחר, כמו תא הסלולר זוהה על ידי סוכרוז או iodixanol צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע באמצעות בווה ubiquitinated כמו סמן עיבוד עירד דמוי. לאחר גירוי שלהם מולדת חסינות, יעילות CP גדל באופן משמעותי, השבר שיא עבור בווה יחד עם ubiquitinated בווה היגרו לשבר צפיפות גבוהה יותר (שלנו שלא פורסמו תוצאות). המטרות של ניסויים אלה היו לזהות סמנים מולקולריים ספציפי עבור מיון או אנדוזום המנוח, אשר הועברו יחד עם בווה או ubiquitinated בווה. אבל בתוצאות, הן מולקולות תושב ER ומולקולות מאוחר אנדוזום תושב הועבר יחד עם בווה, ubiquitinated בווה, המציין כי ניסויים אלה היו כושלים ברור תא הסלולר להעברה כמו עירד ועיבוד ER קלאסית או אנדוזום מאוחר. בניסויים אלה, היו מולקולות ספציפיות לא התאים endocytotic למעט בווה או ubiquitinated בווה. עם זאת, בעוד אקסוגניים אנטיגן עברה עירד כמו תחבורה, מולקולות אלה חדרו קרום bilayer השומנים של חדר המיון דרך translocons, כגון Sec61 מורכבים (איור 1, דמות 2A). קרום דבק בווה נבחר כסמן של התאים endocytic, microsomes היו מטוהרת על-ידי beads מגנטי-SA (איור 2 א, 2 ב). באלה microsomes מטוהרים, בווה שהצטברו נתקלתי עירד דמוי ubiquitination ועיבוד תחת הנוכחות של RL ו- ATP במבחנה (איור 3A, 3B). כיוון RL מכיל את כל apparati cytosolic מולקולרית, כגון מולקולות הקשורות ubiquitination ו- proteasomes בנוסף מולקולות תרגום, תמלול, התוספת של RL מאפשר ubiquitination של בווה ב microsome מטוהרים. תוצאות אלה מציינים כי מטוהרים microsomes היו תאים סלולריים אובייקטיבית עירד כמו תחבורה, עיבוד של אנטיגנים אקסוגני, שניהם המכילה מולקולות ספציפיות אנדוזום ומולקולות שוכנת בחדר המיון באותו הזמן; Lamp1 הראה קודמן וטפסים בוגר microsome מטוהרים.
פרוטוקול זה הוא תלוי כמות חודר ממברנה אנטיגנים אקסוגני; חשוב לשלב מספיק של אנטיגנים אקסוגני לתאים DC2.4, שמציג יכולת גבוהה לשלב אנטיגנים אקסוגני במדינה confluent למחצה. מתארך זמן הדגירה 6-12 h עבור DC2.4 עם בווה מגדילה את כמות בווה incorporated. התוספת של מעכבי proteasomes, MG132 או lactacystin, במתינות מגדילה את כמויות microsomes מטוהרים. הכנת microsome הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר עבור פרוטוקול זה. בווה חינם, אשר היא אינה מעוגנת לתוך תאים DC2.4, יש להסיר על ידי שטיפת התאים עם PBS, כדי למנוע שאינם ספציפיים עקידת בווה חינם השבר microsome. כדי לצמצם את הנזקים על קרום התאים, התאים הם מובסים בקפידה מהמגן דאונס במי קרח. ואז תאים רצופה, גרעינים הוסרו על ידי צנטריפוגה כפי microsomes הוכנו מן השבר כור גרעיני. לאחר הכנת microsomes, מתבצע טיהור בשלב אחד על ידי חרוזים SA-מגנטית. בשלב זה, רחיצת בזהירות microsome מגנט מאוגד יש צורך להסיר את הכריכה לא ספציפית של תאים סלולריים אחרים, ולא לאבד את microsome מאוגדים באופן ספציפי.
בשיטה זו טיהור צעד אחד, נדרש אחוז משמעותי של microsome המטרה. אם היחס בין microsome אובייקטיבית הוא קטן מדי, כמות היעד מטוהרים microsome מקטין על ידי תחרות עם איגוד שאינם ספציפיים של תאים סלולריים אחרים. כתוצאה מכך, בתנאים האלה, את enrichments של microsome המטרה, את הסיווג של microsome שאינם ספציפיים יהיה צורך. אפשרי גם להציג צעדים נוספים לפני טיהור מאת החרוזים SA-מגנטית. צעד כזה הוא סוכרוז או iodixanol צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה של microsome. מאז microsomes מוכן להכיל כל המוצרים ממברנה, זה יכול להיות אפשרי להעשיר את microsome היעד לפני SA-מגנטית טיהור חרוזים על-ידי בחירת אנטיגן שברים עשיר לטיהור צעד אפשרי נוסף הוא סיווג מראש של microsome על ידי שליטה-מגנטית חרוזים בלי SA, כדי להפחית את אגודות שאינם ספציפיים רקע microsomes נגד beads מגנטי-SA. בניסויים אלה, שני צעדים משופרת על טוהר microsome היעד ביעילות, אך פחתה הסכום הכולל של מוצרים מטוהרים, המציין שאלה צעדים נוספים נבחרו כאמצעי לניסויים נוספים.
ידוע שצנטריפוגה במהירות גבוהה זה הוכח לגרום היתוך או קרישה של שלפוחית תאיים. אלה fusions או clottings תפיק microsomes מלאכותי, אשר נגזרות שאינם ספציפיים האינטראקציה בין סוגים שונים של אברון-derived שלפוחית. Microsomes מלאכותיים אלה מכילים סטטיסטית בכל מולקולה ממברנה כגון מולקולה תושב מיטוכונדריאלי, מולקולה תושב גולג'י, ועוד. Microsomes מטוהרים הללו לא כללו caveosome תושב חלבונים, חלבונים תושב גולג'י, או חלבונים תושב אנדוזום מוקדם, כגון caveolin1, GM130, EEA1, המציין כי microsomes SA-לטהר אינם מוצרים מלאכותיים נגזר המיזוג בין סוגים שונים של שלפוחית. ללא צנטריפוגה במהירות גבוהה, שלפוחית. לאונרד-בווה היו מבודדים, אבל הניסויים שליטה של שלפוחית ללא בווה הראתה כמויות גבוהות יותר של מולקולות שאינם ספציפיים. אפשרות זו מציינת כי שיטה ראשונית זו היא די לניסויים רצופים, כי הצעד צנטריפוגה מהירה הכרחי עבור פרוטוקול זה טיהור.
פרוטוקול זה חל על סוגי תאים אחרים, כגון קבוצות משנה DC שונה או אחרים נגמ שים. . זה גם ניתן להשתמש סוגים שונים של אנטיגנים אקסוגני במצבים שונים, כגון חלבונים פלורסנט, קומפלקס אנטיגן-נוגדן, חרוזים מאוגד אנטיגנים, וכו '. יתר על כן, אנו יכולים לטהר microsomes היעד באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד אנטיגנים אקסוגני. למרות מספר פעולות נוספות או שינויים, ייתכן שיהיה צורך להחיל לפרוטוקול זה על תאים ו אנטיגנים אחרים, זה יכול להבהיר את המנגנונים המולקולריים של המוצב פרוטאוזום תלוית על-ידי השוואת מולקולות מטוהרים בין ניסויים שונים. כך, הפרוטוקול המתואר יש חדר שינוי ושיפור.

MHC אני מולקולות באים לידי ביטוי על פני השטח של כל התאים nucleated, עם פפטידים קצרים antigenic נגזר אנטיגנים אנדוגני, אשר מעובדות על-ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום ציטוזול1. לאחר עיבוד, פפטידים antigenic מועברים לתוך לומן (ER) רשתית תוך-פלזמית על ידי פפטיד לגבי המעלית מהברז. ב- ER לומן, סדרה של משגיחים ספציפית לסייע ההעמסה פפטיד, הנכון קיפול של MHC אני מורכבים. סדרה זו של מולקולות נקרא המתחם פפטיד העמסה (PLC), המציינת כי המיון תא מרכזי בשביל פפטיד מעמיסים על MHC אני2. לאחר טעינה, פפטיד MHC אני מולקולות מועברים אל פני השטח של התא, לשחק את תפקיד מרכזי במערכת החיסונית מסתגלת כמו סמני עצמית, ומאפשר CD8+ לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (Ctl) כדי לזהות תאים סרטניים או מדבקים לפי antigenic פפטידים-עצמי חלבונים3.
פפטידים antigenic מ אקסוגני אנטיגנים אנטיגן הצגת תאים (APC), הם גם מוצג בעת MHC אני4,5,6,7,8 דרך CP, אשר מתבצע בעיקר ליד DCs9,10,11. CP חיוני הן עבור הפעלת תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים לתוך אנטי-זיהומית, anti-tumoral Ctl12,13, של קיום רגישות המערכת החיסונית על-ידי inactivating של בפועל עצמית תמים T תאים14,15. החפ ק ממלא תפקידים חשובים רבים במערכת החיסון מסתגלת, אולם טרם ניתן לתאר בפירוט המנגנונים המולקולריים של CP. מחקרים קודמים של CP חשף כי אנטיגנים אקסוגני נרשמו נקודתית הן המיון והן את אנדוזום, שעובדו על-ידי עירד, רומז כי אנטיגנים אקסוגני מועברים מ אנדוזום לחדר המיון עבור עירד כמו עיבוד ופפטיד טעינת16 . עם זאת, ראיות המצטבר עולה הטעינה פפטיד של CP מתבצעת לא בחדר המיון, אלא דווקא בקלאסי מדורים endocytic, יש גם את התכונות המיוחדות של ה ER (איור 1)17,18 ,19,20,21. כדי למנוע השפלה של סימנים מקדימים פפטיד antigenic על ידי פעילות גבוהה של aminopeptidase22 ציטוזול, עיבוד, פפטיד טעינה ב CP מתרחשת באזור הפרוקסימלית של אלה תאים endocytic-קלאסי (איור 1). למרות אפיוני של תאים endocytic אלה שנויים במחלוקת, יש אין מולקולות ספציפיות קיים מלבד אנטיגנים אקסוגני במחלקה הזו.
עירד הוא מסלול סלולרי, אשר במיוחד מסיר חלבונים misfolded מחדר המיון. ב מסלול עירד, חלבונים misfolded retrogradely מועבר דרך קרום אר אל הציטופלסמה, שעובדו על-ידי24,2523,מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כאשר מולקולות גדולות, כגון חלבונים, מועברים דרך ליפידית, מולקולות אלה עוברים דרך מנגנון מולקולרי הנקרא translocon, כגון Sec61 מתחם, מתחם מיון26, ו טום מורכבים Derlin וטים מתחם המיטוכונדריה27. כאשר exogenously-נוסף אנטיגנים מועברים דרך קרום בחדר המיון, הם חייבים לחדור ליפידית במתחם עם translocons, כגון המתחם Sec61. השיטה המתוארת כאן לטהר את שלפוחית ממוקד על ידי ניצול מולקולות אלה חודר ממברנה כסמני עבור התאים endocytic.
השיטה המתוארת כאן הוא פרוטוקול טיהור שלפוחית חדשה באמצעות את התא DC דמוי קו DC2.428 , biotinylated אובלבומין (בווה) כמו אנטיגן אקסוגני. התאים endocytic היו מטוהרת על-ידי streptavidin (SA)-beads מגנטי באמצעות את בווה חודר קרום כמו מכונת. זה מטוהרים microsome, כמה exogenously נוספו בווה השתמר עדיין בחלקים ממברנה אבל היו מועברים אל מחוץ microsome ולאחר מכן ubiquitinated ומעובדים במבחנה29. זה microsome מטוהרים הכיל לא רק חלבונים ספציפיים תא endocytic, אלא גם חלבוני ER-תושב עירד, את פפטיד טעינת מורכבים; רומז תא הסלולר הוא תא endocytic פוטנציאליים עבור CP29. פרוטוקול זה אינו תלוי הסוג של אנטיגנים אקסוגני, והוא גם ישימים עבור קבוצות משנה אחרים DC וסוגי תאים אחרים, כגון מקרופאגים, תאי B ותאי אנדותל, כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי מדויק של בקרי קבוצת מחשבים CP שגורה.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco by life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>gibco by life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids</td><td>gibco by life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>gibco by life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>gibco by life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penisicillin-Sreptomycin</td><td>gibco by life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco by life technologies</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-protein labelling kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F6347</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>lactacystin</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitor cocktails</td><td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>iodixanol</td><td>Cosmo bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>SA-magnetic beads</td><td>New England Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>control magnetic beads</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>silver staining kits</td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Reticulocyte Lysate</td><td>Promega</td><td>1730714</td><td></td></tr><tr><td>Flag-tagged ubiquitin</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td></tr><tr><td>anti-ovalbumin (OVA,mouse)</td><td>Antibody Shop</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>ant-multi-ubiquitin (mouse)</td><td>MBL</td><td>D058&amp;minus;3</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag (mouse)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of the membrane compartment for endoplasmic reticulum-associated degradation of exogenous antigens in cross-presentation

תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים מאוד עיבוד והצגת אנטיגנים אקסוגני למביטה על מחלקה histocompatibility הגדולות (MHC) אני מולקולות הידוע גם בשם צלב-מצגת (CP). CP ממלא תפקיד חשוב לא רק על הגירוי של תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים עבור זיהומיות וחסינות הגידול אלא גם ב איון של self-acting תמים T תאים על-ידי anergy תא T או מחיקה תא T. למרות המנגנון המולקולרי קריטי של CP נשאר כדי להיות הובהר, ראיות המצטבר מעיד כי אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באמצעות רשתית תוך-פלזמית-הקשורים השפלה (עירד) לאחר הייצוא מקלאסי endocytic תאים. עד לאחרונה, אפיוני של תאים endocytic אלה היו מוגבלים כי היו אין סמנים מולקולריים ספציפי חוץ אנטיגנים אקסוגני. השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, אשר מאפשר ולטיהור אלה תאים endocytic. משתמש זה מטוהרים microsome, אנחנו מחדש את עירד כמו תחבורה, ubiquitination, עיבוד של ה אנטיגן אקסוגני במבחנה, רומז כי המערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום מעובד אנטיגן אקסוגני לאחר ייצוא מזה תא הסלולר. פרוטוקול זה יכול להחיל עוד יותר על סוגי תאים אחרים כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי של CP.

התירי את המנגנון המולקולרי של CP, יש צורך לזהות את התאים הסלולר, איפה אנטיגנים אקסוגני עוברים עירד כמו תחבורה, עיבוד. בעוד תצפיות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescent או באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מזוהה תא הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני שנצבר16,17,18,19, 30,31,32,33, התאים הסלולר עירד כמו עיבוד של אנטיגנים אקסוגני אינם מוגדרים בבירור. לאחרונה זה הראו כי endosomes-קלאסי עם מולקולות תושב בחדר המיון היו אחראים על CP34, אבל אלה תאים סלולריים היו ולזרימה. הקושי לבודד וטיהור התאים הסלולר ניתן לייחס לעובדה אנטיגנים אקסוגני מותאמים הן אנדוזום, כמו מיון תאי וכי אין מולקולה מזהים עבור אלה תאים endocytic אחרים מאשר אנטיגנים אקסוגני. עם זאת, התנאי של אנטיגנים אקסוגני שעברו עירד כמו תחבורה שונה ממצב למצב יציב; במעבר על פני הממברנה ריאקציה דו-מולקולרית השומנים, אנטיגנים אקסוגני לחדור את הקרום ויה translocons, כגון Sec61 (איור 2 א). לפיכך, בעת שימוש בווה כמו אנטיגן אקסוגני, בווה אמור להיות משויך Sec61. מאז בווה ממברנה-הקשורים מאוגדים באופן ספציפי עם SA, microsome המוכן DC2.4, אשר היה pretreated עם בווה, יכול להיות מבודדת לגמרי על ידי beads מגנטי-SA (איור 2 א). ואז כמויות שוות ערך של חלבונים מן מטוהרים microsomes עם או בלי קדם דגירה של בווה שנפתרו על ידי מרחביות-דף ואחריו צביעת כסף, סופג המערבי עם SA-HRP (איור 2B, ג 2). כפי שמוצג באיור 2B , איור 2C, microsomes מבודדים הכיל מספר חלבונים ייחודיים היו מטוהרים תלויה בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. בנוסף חלבונים ייחודיים אלה, microsomes מבודדים הכיל גם חלבונים ספציפי, אשר קשורה beads מגנטי-SA עם או בלי בווה. טיפול microsome עם טריפסין לפני טיהור על-ידי המגנט מנעה הטיהור של microsomes (איור דו-ממדי), המציין את שיטות טיהור תלויים הנוכחות של קרום חודר בווה.
Microsomes מטוהרים הראה היכולת ubiquitinate ה בווה incorporated במבחנה, תחת הנוכחות של RLs (איור 3 א). כמויות בווה, בווה פולי-ubiquitinated היו augmented בנוכחות MG132 (איור 3B), המציין בווה incorporated היה מעובד על ידי מערכת עירד שלנו microsomes מטוהרים הכיל עירד מכונות חלבונים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55949/55949fig1.jpg"> 
איור 1: מסלולים תאיים על CP in DCs- ב- Dc, אנטיגנים אקסוגני מועברים לתוך מדורים endocytic-קלאסי, גם מכילים מולקולות אר-תושב בנוסף מולקולות של אנדוזום מאוחר קלאסית. במחלקה הזו, אנטיגנים אקסוגני מיוצאים לתוך ציטוזול דרך translocons כגון Sec61. ב ציטוזול, מעובדים אנטיגנים אקסוגני על ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום לתוך פפטידים antigenic בשם דיאלקטריים עירד. פפטידים antigenic מובלים אל תוך תאי endocytic-קלאסי זהה או סמוכים, או ER סמוכים דרך המעלית מהברז והעמיסו מכן על MHC אני מולקולות על ידי בקר לוגי מיתכנת. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55949/55949fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55949/55949fig2.jpg"> 
איור 2: טיהור של Microsomes עם בווה עירד שעברו. (א) א דגם סכימטי של טיהור של microsomes עם בווה שעברו עירד. בווה מזוהה עם הקרום דרך translocon Sec61, ממוקד עם חרוזים SA-מגנטית. Microsomes (B) עם (+) או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה היו מטוהרים (+) עם או בלי חרוזים SA-מגנטית (-). חלבונים (2 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים שנפתרו בדף-7.5-15% מרחביות, צביעת כסף שימש כדי להמחיש להקות חלבון. משולשים בצד ימין מציינים חלבונים ספציפי מחייב את החרוזים SA-מגנטית. משולשים עם כוכביות מציינים חלבונים ייחודיים נמצאו רק בנוכחות בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. החץ מראה בווה. (ג) Microsomes (+) עם או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה היו מטוהרים (+) עם או בלי חרוזים SA-מגנטית (-). חלבונים (10 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים היו נפתרה בדף-7.5-15% מרחביות, שעבר Western סופג עם SA-HRP. P.N.: שבר כור גרעיני. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. (ד) Microsomes עם תוספת מוקדמת של בווה היו טהור עם חרוזים SA-מגנטית. Microsomes שטופלו (+) או בלי טריפסין (-) ו- TX-100 לפני טיהור (שמאל שני נתיבים) או לאחר טיהור (נכון בשני נתיבים). חלבונים (2 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים שנפתרו בדף-7.5-15% מרחביות, צביעת כסף שימש כדי להמחיש להקות חלבון. משולשים בצד ימין מציינים חלבונים ספציפי מחייב את החרוזים SA-מגנטית. משולשים עם כוכביות מציינים חלבונים ייחודיים נמצאו רק בנוכחות בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. הודפס מחדש באישור מ הפניה28. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55949/55949fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55949/55949fig3.jpg"> 
איור 3: במבחנה הכינון של עיבוד, Ubiquitination באמצעות ביצית Microsomes טהור. Microsomes (א) Purified עם (+) או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה שטופלו (+) או בלי (-) RL, דגל-Ub עבור 1 h, היו solubilized באמצעות TNE. בווה היה טהור עם חרוזים SA-מגנטית, שעבר Western סופג עם נוגדנים המצוין. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. (B) Purified microsomes שטופלו (+) או בלי (-) RL הדגל-Ub, MG132 עבור 1 h, היו אז solubilized באמצעות TNE. בווה היה טהור עם חרוזים SA-מגנטית, נתון סופג המערבי עם SA-דגל. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. הודפס מחדש עם permission מ הפניה28. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55949/55949fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation at JoVE.com

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K Views.  Takasaki University of Health and Welfare. השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.

Video: Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Biochemistry

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

לומדת אורגל דינמיקה ב-B תאים במהלך היווצרות סינפסה החיסונית

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Intralumenal Vesicles and Multivesicular Bodies

Intraluminal vesicles (ILVs) are small vesicles 50-80 nm in diameter formed during the maturation of early endosomes. A specialized endosome containing numerous ILVs is called a multivesicular body (MVB). ILVs contain internalized molecules such as antigens, nucleic acids, proteins, and metabolites. Some of these molecules are released from the MVBs inside exosomes and are transported to other cells. Other MVBs contain molecules that are retained in the ILVs and are later degraded within the cell.
MVBs were first observed in neuronal cells in 1955 using electron microscopy. MVBs have a diameter of 400-500 nm, are spherical, and were initially thought to be a form of the late endosome; however, recent studies have shown that MVBs are an intermediate form of these organelles between the early and the late endosomes.
ILV formation takes place when a ubiquitin-tagged protein enters the cell in an endocytic vesicle and fuses with the early endosome. As the early endosome matures, the endosomal membrane bends inwards to form ILVs. An ESCRT protein complex mediates ILV formation. Phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) is also required for ILV formation. PtdIns3P acts as a docking site for ESCRTs for the bending of the endosomal membrane.
The ESCRT complex and the ATPase, Vps4, required for ILV formation can be hijacked by enveloped retroviruses that infect host cells. Normally, ILVs are formed inside maturing endosomes with the help of ESCRTs within the cell, and the ubiquitin-tagged proteins are recognized and sorted into ILVs. In contrast, retroviruses use the ESCRTs to be released outside the cell. For example, the human immunodeficiency virus (HIV) codes for proteins, such as Gag, NC-p2, and Tat, that require ubiquitination for export. This ubiquitination is essential because ESCRTs and Vps4 recognize and sort only ubiquitin-tagged proteins into viral buds. Once the viral particles bud off from an infected cell, they are released into the extracellular space to infect other host cells.

שלפוחיות intralumenal וגופים multivesicular

Intraluminal vesicles (ILVs) are small vesicles 50-80 nm in diameter formed during the maturation of early endosomes. A specialized endosome containing ...

Education

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

KEY TERMS AND CONCEPTS

Receptor Downregulation in MVBs

Multivesicular bodies (MVBs) are mature endosomes that sort ubiquitinated proteins and then fuse with lysosomes to degrade the sorted proteins. Epidermal growth factor (EGF) and its receptor (EGFR) form a complex that can be internalized through endocytosis, sorted into an MVB, and later degraded.
The EGFR can initiate signaling pathways that&#160; lead to cell proliferation, migration, and differentiation. Overexpression of EGFR&#160; stimulates cells to proliferate. Excessive&#160; EGFR activation may result in cancer; therefore, EGFR expression must be tightly regulated. The degradation of the EGF-EGFR complex through the endocytic pathway is a means of downregulating EGFR and preventing its overexpression.
EGF binding to EGFR induces EGFR dimerization. EGFR is ubiquitinated by a ubiquitin ligase. Ubiquitination triggers the endocytosis of the dimerized EGF-EGFR complex. Once inside the cell, the complex is first sorted into the early endosome. As the early endosome matures, ESCRT proteins, or endosomal sorting complexes required for transport, translocate&#160; the EGFR-EGF complex into intraluminal vesicles (ILVs). Several ILVs are formed inside the maturing endosome, eventually becoming multivesicular bodies (MVBs). MVBs containing the EGF-EGFR complex then fuses with a lysosome for degradation of the EGFR-EGF complex.
Similar to EGFR, cytokine receptors are also internalized and downregulated by MVBs. Ubiquitinated receptor-cytokine complexes are endocytosed and later delivered to MVBs for degradation. The degradation weakens the cytokine signaling. In the case of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor alpha (TNF&#593;) or interleukin-1 (IL-1), any defect in ubiquitination, endocytosis, or degradation of the receptor-cytokine complex through MVB can cause enhanced or sustained signaling. This may lead to inflammatory diseases like Crohn&#39;s disease or rheumatoid arthritis.

הפחתת קולטן ב- MVB

Multivesicular bodies (MVBs) are mature endosomes that sort ubiquitinated proteins and then fuse with lysosomes to degrade the sorted proteins. Epidermal ...

Export of Misfolded Proteins out of the ER

After folding, the ER assesses the quality of secretory and membrane proteins. The correctly folded proteins are cleared by the calnexin cycle for transport to their final destination, while misfolded proteins are held back in the ER lumen. The ER chaperones attempt to unfold and refold the misfolded proteins but sometimes fail to achieve the correct native conformation. Such terminally misfolded proteins are then exported to the cytosol by ER-associated degradation or ERAD pathway for degradation.
Different modes of ERAD pathways
Hrd1 is a ubiquitin ligase and a retro-translocation channel for misfolded polypeptides. It complexes with another membrane protein, Hrd3, to form the core ERAD machinery. The other players associated with these core proteins depend upon the topology of the misfolded protein. The retrotranslocation complex depends on the luminal lectin chaperones to identify misfolded proteins. Studies in the yeast system suggest the presence of ERAD-C, ERAD-L, and ERAD-M pathways to export misfolded proteins from various parts of the ER. The target proteins of the ERAD-L and ERAD-M pathways use the Hrd1 channel to exit the ER lumen and membrane, respectively, while the ERAD-C pathway utilizes the Doa10p ubiquitin ligase complex to degrade the cytoplasmic domains of the ER membrane proteins. Sometimes, these pathways can overlap as some misfolded proteins need translocation machinery from two different ERAD pathways to exit the ER. The mammalian ERAD machinery is more complex than yeast and has multiple proteins that export and mark proteins for proteasomal degradation. Eventually, all ERAD pathways converge due to their dependence on a cytoplasmic AAA-ATPase to provide the mechanical force to extract proteins through the membrane.
Degradation of non-glycosylated proteins
The ER has another lectin-independent system that monitors and clears the non-glycosylated proteins from ER. It consists of the resident ER chaperone, BiP protein, and the ER-localized DnaJ family members (ERdjs). ER stress induces the production of HERP, a ubiquitin-like membrane protein, which assembles with other ERAD proteins like the Hrd1 and AAA-ATPase, forming a complex. BiP uses some ERdj proteins as cofactors to recruit non-glycosylated misfolded proteins to the HERP complex for retrotranslocation and ubiquitination of the misfolded protein. HERP is associated with the proteasome on the cytosolic side, where it delivers the misfolded proteins for degradation.

ייצוא חלבונים מקופלים שלא כהלכה מהמיון

After folding, the ER assesses the quality of secretory and membrane proteins. The correctly folded proteins are cleared by the calnexin cycle for ...

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

Antigen Presenting Cells

The immune system is a complex network of cells and molecules that protects the body from foreign invaders. T cells, a type of white blood cell, play a crucial role in this process. They recognize and attack foreign substances, such as pathogens, that enter the body.
T cells require the help of antigen-presenting cells (APCs), which process foreign antigens into smaller fragments that can be recognized by T cells. These APCs are highly specialized cells that efficiently internalize antigens through phagocytosis or receptor-mediated endocytosis.
Dendritic cells, a type of professional APC, are particularly efficient at antigen processing and presentation. They are highly mobile and can be found in tissues first exposed to foreign antigens, such as the skin, mucosal surfaces, and lymphoid organs.
Macrophages may also function as APCs, and are found in all tissues. They can engulf and process foreign antigens and release cytokines, which activate T cells and other immune cells, thereby coordinating the immune response.
B cells are another type of APC that can present antigens to T cells. When an antigen is presented to a B cell, it activates the B cell to produce antibodies against the antigen. This activation process involves the binding of the antigen to the B cell receptor, followed by a series of molecular signaling events that produce antibodies.
When an APC engulfs an antigen, it breaks into smaller fragments and combines them with major histocompatibility complex (MHC) molecules. The antigen-MHC complex is then transported to the APC&#39;s plasma membrane, where it is presented to a T cell.
The appropriate T cell receptor recognizes the processed antigen complex, triggering an immune response against the foreign invader. This process is crucial for protecting the body from infection and disease.

תאים מציגי אנטיגן

Antigen-presenting cells, also known as APCs, process foreign antigens, such as fragments from pathogens, for recognition by T cells.
When an APC engulfs ...