Name: purification of high molecular weight genomic dna from powdery mildew for long-read sequencing
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing at JoVE.com

This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.

1. הכנת חומר פטרייתיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול אבק טחב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל צמחים בתאי גידול עם התנאים הבאים: 22 ° C יום הטמפרטורה, 20 ° C טמפרטורה בלילה, 80% לחות יחסית, 14-h-אורך היום לבין עוצמת אור של 125 μE / m 2 / s (המסופק על ידי תאורת פלורסנט ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק צמחים מלפפון (מגוון סטיבה Cucumis בוש אלוף) עם UCSC1 זן cichoracearum Golovinomyces כמתואר 18, 29. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר אבק טחב נבגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר נבגים מצמחים נגועים ב 7 - 10 ימים לאחר חיסון באמצעות ואקום קטן עם מסנן ב-קו (11 מיקרומטר) שעליו נבגים לצבור. הפעלת לחץ עדין, להפעיל את זרבובית הוואקום לאורך פני השטח של העלים כדי לאסוף את הנבגים. הערה: התשואה הממוצעת של G. cichoracearum הוא 20 מ&quot;ג של נבגים מתוך בכבדות infeעלה מלפפון cted של כ 130 ס&quot;מ 2 בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מברישים על 150 מ&quot;ג של נבגים (כ 375 נפח μL, או נבגים 7-8 עלים מלפפון נגועים) מהמסנן גבי גיליון נייר נקי. מכאן, להעביר נבגים לתוך 2 מ&quot;ל cryovials עם שני 5/32-inch בקוטר טרום צונן (בחנקן נוזלי) כדורי טחינה פלדה. מיד לחזור צינורות חנקן נוזלי. צינורות חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשפתח נבגים ידי כדור כרסום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא צלחות אלומיניום של טחנת כדור בחנקן נוזלי. טען cryovials לתוך מתלה כדור-הטחנה. נמרצות לנער את cryovials עם כדורי נבגים ופלדה בטחנת הכדור עבור 30 שניות על 30 מחזורים / s (בטמפרטורת החדר). מיד refreeze cryovials בחנקן נוזלי. הערה: בתחילה, לגשת מדגם של נבגים על ידי מיקרוסקופ בהגדלה 100X ליעילות של קרע בדופן התא במהלך שחיקה. במידת הצורך, לטחון עבור תוספת 1 - 2 סבבים של 30 s עבור 30 מחזורים / s, בUT לשמור על מספר סיבובים עד למינימום. הערכה שגרתית של שבירה הנבגים ידי מיקרוסקופ בשלב זה היא מיותרת פעם הוקמו תנאים אופטימליים. </li></ol></li></ol> 2. טיהור DNA הגנומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה נבגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות כדי למנוע הפשרת נבגים, להסיר את כדורי פלדה מ cryovials עם מגנט. הוספת 700 μL 65 ° חיץ תמס C (לוח 1) ו מערבולת 5 - 10 s עד תרחיף נוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL מראש התחמם (C 65 °) 5% (v / v) sarcosyl ו להפוך בעדינות לתערובת (1 היפוך לכל 3 ימים) חמש פעמים. דגירת צינורות עבור 30 דקות ב 65 מעלות צלזיוס; להפוך פעמים 3 בעדינות על 10, 20 ו 30 דק &#39;. בעזרת קצה פיפטה רחב נשא, להעביר פתרון שלם צינור 2 מ&quot;ל microcentrifuge חדש. בכל השלבים הבאים, ומערבבים על ידי היפוך עדין, איטי ולהעביר את פתרונות המכילים DNA עם טיפים פיפטה רחב נשא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת DNA לי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 נפח של כלורוטופס: אלכוהול isoamyl (24: 1 v / v) לפתרון תמוגה להפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, היפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים בנקודת אמצע הדרך ואז שוב בסוף הדגירה. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב 14,000 x ז. באמצעות קצה פיפטה רחב נשא, להעביר את השכבה המימית בזהירות 2 צינור microcentrifuge חדש מ&quot;ל; להימנע כולל חומר מהממשק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA משקעים לי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 נפח בטמפרטורת החדר 100% isopropanol (כ 750 μL) ו להפוך בעדינות לתערובת שש פעמים. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב 14,000 x ז. מוציאים בזהירות את supernatant וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 450 μL מראש מצונן (-20 ° C) אתנול 70%. צנטריפוגה 5 דקות בטמפרטורת החדר בבית g 14,000 x. מוציאים בזהירות את supernatant וזורקים. צנטריפוגה ב 1000 XG במשך 3 ים, להסיר את supernatant בזהירות עם קצה פיפטה בסדר וזורקים. אוויר יבש גלולה במשך 15 דק &#39;טמפרטורת T בחדר. אין לייבש יותר מ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה 300 μL TE (10 מ&quot;מ טריס-Cl, 1 מ&quot;מ חומצה אצטית טטרה diamine אתילן, pH 8.0). דגירה לילה בשעה 4 ° C. בעדינות קפיצי להשעות כל חומר שיורית שלא להיכנס פתרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר זיהום RNA, להוסיף 10 μL RNase A (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). בעדינות להפוך לערבב שלוש פעמים. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 3 s. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת DNA II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1 v / v) ו להפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר, היפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים על מחציתו ושוב בסוף הדגירה. צנטריפוגה 15 דקות בטמפרטורת החדר ב 14,000 x ז. בעזרת קצה פיפטה רחב נשא, להעביר את supernatant צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA משקעים II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5.2 pH אצטט 0.01 נפח 3 M נתרן (approximately 3 μL), להפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים. הוספת 2.5 כרכים טרום צונן (-20 ° C) 100 אתנול% (כ 750 μL). בעדינות להפוך לערבב חמש פעמים. דגירת הלילה בשעה -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 30 דקות ב 4 ° C ב 14,000 x ז. מוציאים בזהירות את supernatant וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 450 μL מראש מצונן (-20 ° C) אתנול 70%. צנטריפוגה 5 דקות ב 4 ° C ב 14,000 x ז. מוציאים בזהירות את supernatant וזורקים. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 3 s. מוציאים בזהירות את supernatant עם טיפ מחק פיפטה בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש גלולה במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה 27.5 μL TE. דגירה לילה בשעה 4 ° C. בעדינות קפיצי להשעות כל חומר שיורית שלא להיכנס פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 2.5 μL לתוך 22.5 μL TE (25 נפח סופי μL) עבור בדיקות בקרת איכות (ראו להלן). חנות ה- DNA דגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד הגשת רצף. עבור אחסון לטווח ארוך, דגימות חנותב -80 ° C ו למזער להקפיא להפשיר מחזורים כדי למנוע מריחה. הערה: נזהרת בעת pipetting בשלב הזה כמו ה- DNA הגנומי המשקל המולקולרי הגבוה יכול להיות קשה פיפטה כראוי, וזה חשוב כדי להבטיח כי &quot;QC Aliquot&quot; הוא ייצוג מדויק של דגימת DNA הגנומי. </li></ol></li></ol> 3. בקרת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוהר מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת ריק TE, להעריך את טוהר מדגם של DNA על ידי טעינת 1 μL של QC Aliquot על ספקטרופוטומטר קטן-נפח. קריאות שיא A260 / A280 ו- A260 / A230. דנ&quot;א טהור יהיה יחס A260 / A280 של יחס כ 1.8 ו A260 / A230 בין 1.8 לבין 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות של הדנ&quot;א הגנומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות של aliquot QC באמצעות ערכת assay כימות מסחרי פעמיים תקועים DNA על פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת איכות DNA לי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ טען 60 הדנ&quot;א הגנומי ng וסולם DNA על ג&#39;ל agarose 0.7% ב 1x טה (40 מ&quot;מ טריס, 20 mM חומצה אצטית, ו 1 mM EDTA, pH 8.0). מנגנון ג&#39;ל לרוץ לעבר 70 V עבור 40 - 45 דקות עד להקות הדנ&quot;א הגנומי כ 2 סנטימטר מן ההפרדה היטב להקת הסולם ניכר. תנאים אלה עשויים צריכים להיות מותאמים המבוססים על מנגנון ג&#39;ל אלקטרופורזה זמין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA איכות הערכת II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען כ 60 ng DNA גנומי סולם DNA משקל מולקולרי גבוה (מתאים ג&#39;ל אלקטרופורזה פעמו שדה) על ג&#39;ל agarose 1% ב TBE 0.5x (44.5 מ&quot;מ טריס, 44.5 מ&quot;מ חומצה בורית, 1 מ&quot;מ EDTA, pH 8.3) ו לרוץ למאגר פועל TBE 0.5x באמצעות 5 - פרוטוקול ג&#39;ל אלקטרופורזה פעם שדה צורת גל KBP 80 עבור 16 h. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת חיידקים, פטריות, צמחים ומזהמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את המפרידים עבדו הפנימיים המתאימים האזורים (ITS) של גני ריבוזומלי באמצעות פריימרים ותנאי הגברת רשימהed בטבלה 2. טען 10 μL של התגובה הנובעת מהם על ג&#39;ל. הערה: להקה המייצגת את הטחב אבק באזור שלה צריך להיות מוגבר עם פריימרים ITS פטרייתיים. דנ&quot;א amplicon זה וכל amplicon שנוצר עם פריימרים החיידקים, או הצמח צריך להיות רצף כדי לקבוע את מקור הזיהום. טחב אבק רק רצפי ITS צריך להימצא amplicon פטרייתיים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Pathology. , (1969).</li><li>Braun, U., Cook, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , (2012).</li><li>Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+Blumeria+graminis+indicate+dynamic+changes+to+primary+metabolism+during+development+of+an+obligate+biotrophic+pathogen.">Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen.</a> Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).</li><li>Glawe, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+powdery+mildews:+A+review+of+the+world's+most+familiar+(yet+poorly+known)+plant+pathogens.">The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).</li><li>Fabro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profiling+Arabidopsis+at+the+stage+of+Golovinomyces+cichoracearum+haustorium+formation.">Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).</li><li>H&#252;ckelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction.">Cell biology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).</li><li>Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+a+specialized+plant-fungal+interface+during+host+cell+internalization+of+Golovinomyces+orontii+haustoria.">Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria.</a> Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).</li><li>Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+Arabidopsis+cells+at+the+powdery+mildew+infection+site+reveals+site-specific+processes+and+regulators.">Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators.</a> Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).</li><li>Spanu, P. D., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Powdery+mildew+genomes+in+the+crosshairs.">Powdery mildew genomes in the crosshairs.</a> New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).</li><li>Vela-Corc&#237;a, D., Romero, D., Tor&#233;s, J. A., De Vicente, A., P&#233;rez-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transformation+of+Podosphaera+xanthii+by+electroporation+of+conidia.">Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia.</a> BMC Microbiol. 15 (20), (2015).</li><li>Hacquard, S., Francis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Botanical Research. 70, 109-142 (2014).</li><li>Spanu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+expansion+and+gene+loss+in+powdery+mildew+fungi+reveal+tradeoffs+in+extreme+parasitism.">Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism.</a> Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).</li><li>Wicker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wheat+powdery+mildew+genome+shows+the+unique+evolution+of+an+obligate+biotroph.">The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph.</a> Nat Genet. 45 (9), 1092 (2013).</li><li>Jones, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+genomic+structural+variation+in+the+grape+powdery+mildew+pathogen,+Erysiphe+necator.">Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator.</a> BMC Genomics. 15, 1081 (2014).</li><li>Thomma, B. P. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap;+seven+reasons+to+close+fragmented+genome+assemblies.">Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies.</a> Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).</li><li>Parlange, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+invasion+of+transposable+elements+accounts+for+the+large+size+of+the+Blumeria+graminis+f.sp.+tritici+genome.">A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome.</a> Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).</li><li>Faino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+real-time+sequencing+combined+with+optical+mapping+yields+completely+finished+fungal+genome.">Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome.</a> mBio. 6, (2015).</li><li>Adam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Erysiphe+cichoracearum+and+E.+cruciferarum+and+a+survey+of+360+Arabidopsis+thaliana+accessions+for+resistance+to+these+two+powdery+mildew+pathogens.">Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens.</a> Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).</li><li>Bourras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+avirulence+loci+and+allele-specific+effector+recognition+control+the+PM3+race-specific+resistance+of+wheat+to+powdery+mildew.">Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew.</a> Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).</li><li>Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant genotyping II: SNP technology. , (2008).</li><li>Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+simple+method+for+extracting+next-generation+sequencing+quality+genomic+DNA+from+recalcitrant+plant+species.">Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species.</a> Plant Methods. 10 (21), (2014).</li><li>Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+inexpensive+method+for+removing+polysaccharides+from+plant+genomic+DNA.">A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA.</a> Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).</li><li>Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+CTAB+and+TRIzol+protocols+improve+RNA+extraction+from+chemically+complex+Embryophyta.">Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta.</a> Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105 (2015).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).</li><li>Greco, M., S&#225;ez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+method+for+high+quality+co-extraction+of+genomic+DNA+and+total+RNA+from+low+biomass+Ectocarpus+siliculosus,+the+model+brown+alga.">A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga.</a> PLoS One. 9 (5), e96470 (2014).</li><li>Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+analysis+of+powdery+mildew+disease+resistance+in+the+Arabidopsis+thaliana+accession+Kashmir-1.">Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1.</a> Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

על מנת לקבל טהור, הדנ&quot;א הגנומי משקל מולקולרי גבוה מן פטריות וטחב אבקתי biotrophic לחייב, גרסה שונה של השיטות שתוארו קודם לכן פותחה 30. התשואה הממוצעת באמצעות פרוטוקול מותאם זה DNA 7 מיקרוגרם לכל 150 מ&quot;ג נבגים, הכפלה של התשואה המתקבלת עם פרוטוקול מוקדם. כמו כן, א...

<html> קימחון הם קבוצה של צמחים biotrophic פטרייתיים לחייב פתוגנים, כאשר נלקח יחד, הם הגורם הגדול ביותר של מחלות צמחים ברחבי העולם 1. ישנם מעל 900 מינים מתוארים של טחב אבקתי, אשר קובצו טקסונומית לחמש שבטים בתוך המשפחה Erisyphaceae 2. הן בשל חשיבותה הכלכלית שלהם ואת היחסים האינטימיים שהם מפתחים עם מארחיהם, מחלות טחב אבקתי כבר נושא למחקר עבור&gt; 100 שנים. לאחר ההדבקה, קימחון לעורר שינויים דרסטיים במבנה הסלולר, חילוף החומרים וביולוגיה מולקולרית של מארחיהם, ליהנות פתוגן זה. עם זאת, המחקר של קימחון הוא מאתגר במיוחד בשל אורח חי מחייבים שלהם, והצמיחה של הפטרייה בתרבות טהורה טרם תארה 3, 4, 5,&quot;Xref&quot;&gt; 6, 7, 8. שינוי גנטי אמין ויציב של קימחון יש גם עדיין לא הושג, למרות שינוי חולף דווח בכמה מינים 9, 10. והרצף וההרכבה של הגנום טחב אבקתי הוכיח קשים בשל מספר התכונות של הגנום עצמו. הגנום טחב אבקתי גדול (120 - 180 MBP) ביחס הגנום פטרייתיים אחר, וכולל 60 - 90% אלמנטים חוזרים מופצים באופן שווה 11. אלמנטים אלה כוללים חזרות הטרמינל הלא-ארוכות, כמו גם אלמנטים חוזרים ללא קטגוריה. שני speciales formae של מיני טחב אבקה יחידים, F graminis Blumeria. sp. hordei ו F. sp. tritici (BGH ו bgt, בהתאמה) וכן טחב אבקתי ענבים Erysiphe necator, יש דבוריםn רצף, ואת הגנום טיוטה עבור כמה אחרים הושלמו 12, 13, 14. האופי החוזר ונשנה של הגנום עשה הרכבה קשה, ואת הגנום BGH השלימה הורכב לתוך 6989 supercontigs עם L50 של 2 Mb 12. למרות בגנום גדול, קימחון נראה שיש מספר קטן של גנים המקודדים חלבונים, עם 5845 ו 6540 גנים החזוי BGH ו bgt, בהתאמה. קימחון הרצף גם נראה חסר לפחות גני ליבה 99 כי הם חיוניים פטריות אחרות, אשר עולה בקנה אחד עם התלות של הפטריות על הצמח הפונדקאי שלהם להישרדות 11, 12, 13, 14. רצפים חוזרים ליד telomers, צנטרומר, RN הריבוזומיתמערכי גנים ואזורים המועשרים ב מאלמנטים ניידים הם מאורגנים מן אסטרטגיות רצף קצרות לקריאה ולעתים קרובות הם תת ייצוג המכלולים הגנום 15. אזורים כאלה נחשבים אחראים רבים של הפערים המתרחשים רצפי גנום, וזה חל על הקימחון עם ההתרחבות שלהם הנרחבת של אלמנטים חוזרים 16. Highly אזורים בגנום פלסטיק נמצאים בדרך כלל באזורים חוזרים כגון 3. הם משמשים כאתר של שיחלופים כרומוזום ולעתים קרובות לקודד גנים תחת לחץ סלקטיבי חזק, כגון גנים המקודדים חלבונים מפעיל ואת הגנים המקודדים אנזימים של המטבוליזם המשני. התקדמות בטכנולוגיות סידור מולקולה בודדת לקריאה ארוכה מספקת פתרון אפשרי עבור סידור פני אזורים חוזרים של הגנום 15. לדוגמה, Faino ואח. (2015) מצאו כי ארוך רצף כולל לקרוא טכנולוגיות מטר אופטיapping מותר להם לייצר רצף הגנום פחות פער לשני זנים של דליית Verticillium הפתוגן צמח פטרייתיים, שולש שיעור רצפי DNA חוזרים בגנום, הגדלת מספר הסברי גן (וצמצום מספר סברי גן חלקי או חסר ) ו הגנום חושפני שיחלופים 17. כדי להעסיק טכנולוגיות רצף ארוכות לקרוא אלה, ריכוזים גבוהים של הדנ&quot;א הגנומי באיכות גבוהה, עם גדלים מינימאלי&gt; 20 KBP, נדרשים. כאן אנו מתארים את השיטות שלנו לאיסוף נבגים, טיהור של דנ&quot;א משקל מולקולרי גבוה מ נבגים והערכות בקרת איכות שלנו באמצעות מיני טחב אבקה Golovinomyces cichoracearum גדלו על מלפפון 18. פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול שפותח בקבוצה מעבדה B. קלר (אוניברסיטת ציריך, ציריך שוויץ) 13, 19וכולל מספר שינויים שהובילו תשואות DNA מוגברות שיעור גבוה יותר של ה- DNA&gt; 48.5 KBP בגודלם. הפרוטוקול כולל גם צעדי בקרת איכות מבוססות על המלצות מארה&quot;ב מח&#39; הגנום משותף אנרגיה במכון 20, 21, 22. הפונקציה של כל מגיב הכלול במאגר תמוגה, ואת הרציונל לכל שלב טיהור, מתוארת כמו הנרי (2008) 23. פרוטוקולים שפורסמו זמין עבור בידוד של DNA גנומי משקל מולקולרי גבוה מרקמות הצמח מיקרוביאלי היו התייעץ גם בשלבי התכנון של פרוטוקול זה 24, 25, 26, 27, 28.

<table><tbody><tr><td>MM400 Ball Mill</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>Or equivalent ball mill</td></tr><tr><td>2 mL tubes for ball milling</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>5/32&quot; stainless steel milling balls</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Or equivalent water bath</td></tr><tr><td>Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37 &amp;deg;C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Or equivalent water bath</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge</td><td>Krakeler Scientific&amp;nbsp;</td><td>38-022621807</td><td>Or equivalent microcentrifuge</td></tr><tr><td>Chlorform:IAA (24:1 v/v)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C0549</td><td>Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:IAA&lt;br /&gt; (25:24:1 v/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood</td></tr><tr><td>100% Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>34923</td><td>Chill to -20 &amp;deg;C prior use</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnase, Dnase-free (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Potassium metabisulfite</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Lauryl Sacroinate</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>Or equivalent eyewear</td></tr><tr><td>High Five COBALT nitrile gloves, LARGE</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>Or equivalent gloves</td></tr><tr><td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000x in water</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear</td></tr><tr><td>Agarose Ultrapure Bioreagent</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb CHEF DNA size standards</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>Or equivalent pulse-field gel aparatus</td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper, Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>WHA1001042</td><td>Or equivalent growth chamber</td></tr><tr><td>Percival Growth Chamber</td><td>Percival</td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>Or equivalent spectrophotometer</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>Dilute 1/50 with water before use (to 1x)</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA, 10x Solution (Electrophoresis)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>Dilute 1/10 with water before use (to 1x)</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td>Liquid nitrogen (-196 &amp;deg;C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container</td></tr></tbody></table>

purification of high molecular weight genomic dna from powdery mildew for long-read sequencing

פטריות טחב אבקה הן קבוצה של פתוגנים צמח פטרייתיים חשובים מבחינה כלכלית. יחסית מעט מאוד ידוע על הביולוגיה והגנטיקה המולקולרית של פתוגנים אלה, בין השאר בשל חוסר משאבים גנטיים גנומי מפותח. יש אורגניזמים אלה הגנום גדול, החוזרות על עצמן, אשר הפכו הגנום רצף והרכבה להחריד קשה. כאן, אנו מתארים שיטות לאיסוף, מיצוי, טיהור בקרת איכות הערכת הדנ&quot;א הגנומי משקל מולקולרי גבוה ממיני טחב אבקה אחד, Golovinomyces cichoracearum. הפרוטוקול המתואר כולל הפרעה מכנית של נבגים ואחריו מיצוי DNA גנומי מותאם פנול / כלורופורם. תשואה אופיינית היתה DNA 7 מיקרוגרם לכל 150 נבגים מ&quot;ג. ה- DNA הגנומי כי הוא מבודד באמצעות הליך זה מתאים רצף ארוך לקרוא (כלומר,&gt; 48.5 KBP). אמצעי בקרת איכות על מנת להבטיח את הגודל, תשואה, וטוהר של הדנ&quot;א הגנומי הם גםהמתוארים בשיטה זו. רצף של הדנ&quot;א הגנומי של האיכות המתוארת כאן יאפשר ההרכבה וההשוואה של הגנום טחב אבקתי מרובה, אשר בתורו יוביל להבנה טובה יותר ושיפור שליטת הפתוגן חקלאי זה.

דוגמה מייצגת של 60ng הדנ&quot;א הגנומי מטוהרים מן G. cichoracearum להריץ על ג&#39;ל agarose באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה ושימוש ג&#39;ל אלקטרופורזה פעמו שדה מוצגים איורים 1 ו 2, בהתאמה. הכנות DNA הגנומי שעוברים, שולי לעבור להיכשל בקרת איכות מי...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing at JoVE.com

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

purification-high-molecular-weight-genomic-dna-from-powdery-mildew

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K Views.  University of California Berkeley. Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Video: Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Environment

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription factors (TFs), chromatin regulators, and histone modifications, as well as detecting entire genomes for uncovering TF binding patterns and histone posttranslational modifications. Chromatin-modifying activities, such as histone methylation, are often recruited to specific gene regulatory sequences, causing localized changes in chromatin structures and resulting in specific transcriptional effects. The rice blast is a devastating fungal disease on rice throughout the world and is a model system for studying fungus-plant interaction. However, the molecular mechanisms in how the histone modifications regulate their virulence genes in Magnaporthe oryzae remain elusive. More researchers need to use ChIP-seq to study how histone epigenetic modification regulates their target genes. ChIP-seq is also widely used to study the interaction between protein and DNA in animals and plants, but it is less used in the field of plant pathology and has not been well developed. In this paper, we describe the experimental process and operation method of ChIP-seq to identify the genome-wide distribution of histone methylation (such as H3K4me3) that binds to the functional target genes in M. oryzae. Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.

ניתוח כלל-גנומי של הפצת שינויים בהיסטון באמצעות שיטת רצף האימונו-הוצאה כרומטין במגנפורטה אוריזה

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biology

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bioengineering

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...