מחקר זה מומן על ידי האגודה לסוכרת נעורים 1-FAC-2014-243-A-N, עדה 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 טייס פיג'יי, ואת רוברט ג'ניס מקנייר קרן.
אנו מודים Pena סנדרה ומקדונלד Andrene על גיוס החולה, סמואל בלום לקבלת סיוע טכני, ד ר ג'ורג Makedonas על המתנה של נוגדנים ושליטה DNA משמש PCR אופטימיזציה.

<ol>
	<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision.">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li><li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+fate+and+intense+debate:+myths,+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice.">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li><li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+naive+CD4++T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection.">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li><li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice.">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li><li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated,+cell-autonomous+event.">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li><li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice.">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li><li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days.">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+'self-cleaving'+2A+peptide-based+retroviral+vector.">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+retrogenic+mice:+a+rapid,+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice.">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li><li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice.">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li><li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity.">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li><li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice.">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice:+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer.">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים שיטה יעילה עבור הגברה TCR תא בודד ו עוקבות תת שיבוט לזווג TCR אלפא ביתא רשתות לתוך תבנית הביטוי retroviral וקטור. למרות זאת, פותחו מספר פרוטוקולים PCR תא בודד, אף עד כה תואם מיידית תת שיבוט לתוך וקטור ביטוי. ברוב המקרים, רצף חלקי המקיף את האזורים CDR3 משתנה מאוד מוגבר, עם מספיק רצף להסיק האזור משתנה. זה גודל קטן יותר של מוצר ה-PCR תומך PCR יעילות גבוהה יותר, אך מחייבת דה נובו TCR ג'ין סינתזה ללימודי פונקציונלי. בפרוטוקול הנוכחי שומר על היעילות של תא בודד ממוקדות CDR3 שפורסמו בעבר TCR רצפי פרוטוקולים, בזמן בו זמנית מניב אמפליקון ארוך המכיל את האזור משתנה לגמרי מתאים שיבוט. לכן, המערכת המתוארת יש גמישות מוגברת של נתינה של רצף כמותי, וכן פלט פונקציונלי.
בהתאם השאלה המדעית התייחס, מקור וספציפיות של תאי T ניתח יכול להשתנות. עם זאת, אם היעד הסופי של הפרויקט הוא הניתוח של הפונקציה TCR ויוו , זה צורך להכיר את ההגבלה הלע תאי T מבודד. בפרוטוקול הנוכחי תוכנן במיוחד כך שיהיה תואם ויוו TCR ביטוי בעכברים humanized הלע. רבים של עכברים אלה נוצרו, עכשיו הם זמינים מסחרית, לרבות הלע-A2.1, הלע-DQ8 (הלע-DQA1 * 301, הלע-DQB1 * 302), הלע-DQ6 (DQA1 * 0102, HLADQB1 * 0602), הלע-DR4 (DRB1 * 0401), הלע-DR1 (DRA * 0101, DRB1 * 0101), הלע-A11 (A * 11:01/K), הלע-B2705, הלע-A24, הלע - B * 0702 הטרנסגניים זנים. פרוטוקול זה ניתן לשלב בהצלחה עם פרוטוקול שפורסמו קודם לכן עבור retroviral מח עצם בתיווך ביטוי תאי הגזע האנושי TCRs4,15,16. אנו מצפים כי מערכת retrogenic TCR humanized יהיה רלוונטי ושימושי מאוד לניתוח פונקציונליים של האדם TCRs שונות אוטואימונית, סרטן, ומודלים זיהומיות.
התא הבודד הנוכחי PCR פרוטוקול מתאר את השלבים הקריטיים ונותן הצעות הכרחי עבור הגברה מוצלחת של TCR לזווג-אלפא ורצפים TCR בטא. השלב הקריטי הראשון היא הופעה במועד של cDNA שעתוק, לאחר מכן בסיבוב הראשון של ה-PCR מולטיפלקס. כל השלבים הכרוכים צריכה להתבצע באופן מסודר, כל ריאגנטים, תאי שמר על קרח כדי למנוע השפלה RNA ו- cDNA. שנית, מאחר הפרוטוקול נועדה להיות רגישה מאוד לרמות נמוכות של התבנית, לא רגישים מאוד זיהום. לכן, זה הכרחי לעבודה באזור ללא תבנית, מוצרי ה-PCR מוגבר או TCR וקטור שיבוט. חדר נפרד או המנוע אמור לשמש להגדרת cDNA ותגובות PCR. תבנית מתוך התגובה הראשונה של ה-PCR צריך להתווסף באיזור שונה מאיפה ה-PCR מוגדר. רצוי כי ערכה נפרדת של ריאגנטים aliquoted להשתמש עבור הניסויים PCR תא בודד.
פרוטוקול זה במיוחד מוטבה באמצעות של ריאגנטים המופיעים בטבלה של חומרים, כל ההחלפות של ריאגנטים ידרוש מיטוב נוספות. הזיהוי הראשוני של תאים אנטיגן ספציפי יכול להיות שונה לשימוש tetramers פפטיד-MHC. Tetramer מכתים מאפשר הערכה בו זמנית של ירידה לפרטים אנטיגן, וכן הלע-הגבלה. שיטות אלטרנטיביות עבור זיהוי אנטיגן תגובתיות, כגון קולטנים upregulation של סמני הפעלה מוקדמת או הפרשת ציטוקינים דלקתיים יכול להיחשב בהיעדרו של ריאגנטים tetramer. לדוגמה, ירידה לפרטים כפול פיוז'ן נוגדנים ספציפיים עבור תא T אנטיגן ו IFNγ יכול להיות משולב עם חרוז מגנטי בידוד להעשיר עבור תאים IFNγ בהפקת תגובתי אנטיגן.
בעוד הבונה אדם chimeric/עכבר שמתואר פרוטוקול שלנו מבטיח תאימות עם התאים בעכבר, לרמת התאימות שלו ל- CD3 האנושית מורכבת אינו ידוע. אמנם לא באופן רשמי נבדק על ידינו, אחרים הראו כי המבנים chimeric TCR עם אזורים קבוע מאתר יכול לבוא לידי ביטוי על פני השטח של לימפוציטים אנושיים17. אפשרות זו מציינת כי מאתר TCR אזורים קבוע יכול לתמוך באינטראקציה עם אדם CD3 באיתות מורכבים. עם זאת, אם המטרה היא לבטא את TCRs מזוהה תאים אנושיים הראשי או שורות תאים אנושיים, כגון תאים Jurkat, גישה אופטימלית יותר ייתכן להשתמש בונה אנושית לחלוטין. זה יכול להתבצע על ידי החלפת אזורים קבוע מאתר בתוך וקטור עם אזורים קבוע אנושי.
אם אזור משתנה מזוהה TCR מכיל אתרים הגבלת שימוש עבור שכפול, TCR צריך להיות מוכנס לתוך וקטור הסעות, לאחר מכן עבר מוטציה באמצעות ערכת מוטגנזה מכוונת בוים אתר לזירוז שינוי נוקלאוטיד שקט בתוך ההגבלה חותכים את האתר. גישה חלופית היא דה נובו סינתזה של האזור משתנה TCR עניין שונה כדי לא לכלול אתר ההגבלה לא רצויים.
המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא חוסר היכולת לחסל הגברה של שרשראות אלפא 'cytoplasmic' משני. TCR-אלפא גנים לא עברה הדרה allelic כמו גנים TCR בטא, ולכן שחלק ניכר בתאי T מבטאים שרשרת אלפא 'cytoplasmic'14משני. הפרוטוקול המתואר PCR תוצאות רק הגברה של אחד שרשרת אלפא TCR, אך אם שרשרת אלפא מוגבר שרשרת אלפא 'cytoplasmic' זה לא ייתכן לשייך שרשרת ביתא מוגבר. לכן, זה הכרחי כדי לבדוק ביטוי פני השטח של התא TCR בתאים HEK293T כדי להבטיח רשת המצליחה זיווג.

הקולטן תא T (TCR) מכתיבה תא T ההחלטה לגורל במהלך הפיתוח, מצב יציב/הומאוסטזיס, גירוי antigenic לפריפריה1,2,3. הרחבת האחרונות עמוק רצף טכנולוגיות חשף מגוון TCR בעבר מעריכים בתוך אנטיגן ספציפי תא T תגובות. TCR גיוון מצביע על פוטנציאל תא T פונקציונלית רחבה של תגובות. על מנת לשלב את ניתוח רפרטואר של רצף TCR עם TCR מבחני פונקציונלי, הגישות רצף צריך להיות מתוכנן כך שיהיה תואם מערכות ניסויית ומודלים ויוו מנוצל לניתוח פונקציונלי עוקבות של בחירה TCRs. לנו יש פיתח גישה יעילה עבור האדם TCR רצף בידוד של תת שיבוט לתוך TCR אדם chimeric/עכבר תבנית וקטורית תואם TCR ביטוי עכברים humanized הלע4. בידוד של שרשראות אלפא, ביתא המתאים של heterodimeric TCRs דורש הגברה PCR של שתי שרשראות של תא בודד. למרות, יש TCR תא בודד מספר פרוטוקולים שיבוט פותחה, מנוצל, אף אחד עד כה בקלות תואם עם תפוקה גבוהה יעיל ישירה שכפול של TCRs Vα/Vβ לא ידוע לתוך הכרחי עבור הביטוי מחדש ויוו retroviral וקטורים 4,5,6,7. מחקרים קודמים נעזרו שתי גישות הגדולות, גם להגביר באופן סלקטיבי של חלק מוגבל TCR מספיקות כדי לנחש את הרצף או כדי להגביר את כולו TCR רצף4,5,6 , 7. אנליזה פונקציונלית במורד הזרם של רצפי TCR להשיג באמצעות הגישה הראשונה דורשת יקר סיליקו הרכבה דה נובו בנייה של TCR. בעוד הגישה השניה מספק את רצף TCR מלאה, באזור קבוע האנושית אינה תואמת ויוו ביטוי TCRs משובטים במודלים של העכבר. הגישה שלנו היא תוכננה במיוחד כדי שיהיה תואם ויוו אנליזה פונקציונלית של TCRs במודלים של העכבר. פיתחנו מפושטת ויעילה יחיד תא PCR פרוטוקול המאפשר ישירה תת שיבוט של PCR קטעים לתוך תבנית הביטוי וקטור.
הגישה שלנו מנצל רגישה מאוד מולטיפלקס-מקונן PCR תגובה מבוצעת בשני שלבים. התגובה הראשונה מולטיפלקס בשלב שלולית ספציפיות עבור כל הרשתות V-בטא 40 תחל ובריכה של 44 תחל ספציפיים עבור כל הרשתות V-אלפא משמשים כדי להגביר את TCR-אלפא או בטא TCR ללא ידיעת מוקדמת של הרצף (טבלה 1). פריימר לפנים יש רצף מתאם, שסופחה לתוך 5' של המוצר ה-PCR. ומהצמיגים הפוכה מבוססת על אזור קבוע TCR. זיהינו הגבלת ייחודי אתרים, נעדרו למשתנה האנושי או צומת TCR אזורים, ושילבו האלה לתוך תחל TCRα ו- TCRβ נייווי (איור 1). התגובה השניה מקוננים, פריימר ספציפיות עבור הרצף מתאם ו פריימר הפוכה מקוננים בתוך אזור קבוע משמשים כדי להגביר עוד יותר את השלשלאות TCR עם ירידה לפרטים מוגברת (טבלה 1, איור 1). לאחר בידוד תא בודד, 2 כדורים של ה-PCR (התגובה הראשונה עם מאגר של צבעי יסוד הן Vα והן Vβ, ועם השנייה תחל מתאם) במוצר ה-PCR זה יכול להיות ישירות תת משובטים לתוך תבנית retroviral וקטור. הבונה TCR הסופי לקודד, בתוך מסגרת קריאה פתוחה יחיד (ORF), אנושי אזורים משתנה בשילוב עם העכבר קבוע אזורים מחוברים על ידי הרצף חלבון 'שהפריד עצמית', P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. רצף P2A נעשה שימוש במערכות מרובות, נבדק באופן מקיף במיוחד עבור הביטוי TCRs8,9,10,11. למרות, אחרי תרגום מרבית השרידים רצף P2A קשור קצה קרבוקסילי שרשרת אלפא מחובר באמצעות מקשר גמיש, ואילו רצף אות שרשרת ביתא של פרולין נוספים, שינוי זה יש השפעה מזיקה על תפקוד TCR. אזור קבוע העכבר נמצא בשימוש הבונה במקום האדם להימנע פוטנציאליים שינו אינטראקציות עם רכיבים איתות במורד הזרם כאשר הביע מחדש בתאי עכבר. ORF יחיד תגרום בביטוי נפרדים stoichiometric של אלפא, בטא שרשראות9,11. בפרוטוקול הנוכחי מושתת על ריאגנטים, גישות זמינים באופן נרחב, והוא נועד להתבצע בצורה מפושטת ויעילה. למרות במיוחד השתמשנו בטכניקה זו כדי assay TCRs מתאי T self-reactive מעורבים סוכרת אוטואימונית, אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות החלים נרחב עבור זיהוי והערכה תפקודית של ספציפיות עבור האדם TCRs epitopes אוטואימונית, סרטן epitopes או התגובות פתוגנים וחיסונים.

<table><tbody><tr><td>CFSE&amp;nbsp;</td><td>eBioscience&amp;nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-human CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 AF647</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT enzyme)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polymerase 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Well Half Skirt PCR Plate</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Clear Adhesive Film&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (insert) 30 U (vector)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Quick ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps DNA purification systems&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps DNA purification systems&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA clean &amp;amp; concentrator-25 kit</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA clean &amp;amp; concentrator-5 kit</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)</td><td>Mirus&amp;nbsp;</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II (sorter)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (flow cytometer)</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs

למרות זאת, פותחו מספר שיטות רצף של תא T מזווג קולטן (TCR) שרשראות אלפא, ביתא מתאי T יחיד, אף אחד עד כה להצטיינות במורד הזרם ויוו אנליזה פונקציונלית של TCR heterodimers. פיתחנו פרוטוקול משופר מבוסס על שני שלבים מולטיפלקס-מקונן PCR, כשהתוצאה היא מוצר ה-PCR המתפרס על כל משתנה מחוזות האדם TCR אלפא ביתא רשתות. על ידי זיהוי אתרים ייחודיים הגבלת שילוב אותם תחל ה-PCR, עשינו את המוצר PCR תואם ישירה תת שיבוט לתוך תבנית retroviral וקטור. הבונה retroviral וכתוצאה מכך מקודד chimeric האדם/TCR עם העכבר העכבר מחשבים תאיים, אשר מתפקד בתאי עכבר או במודלים העכבר ' ויוו . בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן משלב האנושי תא בודד לזווג TCR אלפא, ביתא שרשרת הזדהות עם דור יעילה וישימה ברצון retroviral וקטורים לביטוי TCR במבחנה , ויוו . הוידאו והחומרים הנלווים מתוכננים לתת תיאור מפורט מאוד של התא הבודד PCR, כך לשלבים הקריטיים יכול להיות החסרונות שהופעלו ופוטנציאליים להימנע. בנוסף, אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים שיבוט הדרושים ליצור ביטוי וקטור. לאחר mastered, כל התהליך מתא יחיד מיון לביטוי TCR יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של שבועיים.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs at JoVE.com

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

המשלב בפרוטוקול הנוכחי לתא בודד לזווג אדם TCR אלפא, ביתא שרשרת רצף עם אווירודינמית דור תואם במבחנה ויוו TCR והביטוי retroviral וקטורים.

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

9.4K Views.  Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital. המשלב בפרוטוקול הנוכחי לתא בודד לזווג אדם TCR אלפא, ביתא שרשרת רצף עם אווירודינמית דור תואם במבחנה ויוו TCR והביטוי retroviral וקטורים.

Video: Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

פרוטוקול יעיל ליצירת תאי CAR-T בעכבר במודלים סינגניים

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological malignancies and are presently undergoing development for the treatment of diverse solid tumors. So far, the preliminary evaluation of novel CAR-T cell products has predominantly taken place in xenograft tumor models using immunodeficient mice. This approach is chosen to facilitate the successful engraftment of human CAR-T cells in the experimental setting. However, syngeneic mouse models, in which tumors and CAR-T cells are derived from the same mouse strain, allow evaluation of new CAR technologies in the context of a functional immune system and comprehensive tumor microenvironment (TME). The protocol described here aims to streamline the process of mouse CAR-T cell generation by presenting standardized methods for retroviral transduction and ex vivo T cell culture. The methods described in this protocol can be applied to other CAR constructs beyond the ones used in this study to enable routine evaluation of new CAR technologies in immune-competent systems.

מחבר זרקור: שיפור תפקוד תאי CAR-T במודלים סינגניים של גידולים 

This protocol streamlines retroviral vector production and murine T cell transduction, facilitating the efficient generation of mouse CAR-T cells.

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>טרנסדוקציה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לעריכת גנים בהתמיינות Th17

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

יצירה

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה