עבודה זו נתמכה על ידי מענק דוקטורט מאוניברסיטת אנטוורפן VA; המילגה דוקטורט של קרן המדע פלמית (FWO, 11ZI916N) כדי KS; מענקי פרויקט מן FWO (G0D0514N); פעילות מחקרית מתואמת מענק מחקר (GOA), &quot;גישה ביולוגיה מערכות של ליף המורפוגנזה&quot; ממועצת המחקר של אוניברסיטת אנטוורפן; הפולנים ואת המשיכה הבינאוניברסיטאי (IUAP ז / 29, MARS), &quot;תירס ו ארבידופסיס רוט ולירות צמיחה&quot; ממשרד מדיניות המדע הפדרלית הבלגית (BELSPO) כדי GTSB האן Asard, Sizani Bulelani ל &#39;חמאדה AbdElgawad כל תרמו וידאו .

הערה: הפרוטוקול הבא לניתוח קינמטיקה תקף רק עלים במהלך הצמיחה יציבה. זה מצביע על שיעור התארכות עלה יציב ודפוסי מרחב של אורך תא והתרחבות עלה במהלך תקופה של מספר ימים 6. צמח צמיחת 1. ומדידות של דרג התארכות ליף (הימלר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עלו בצמיחה יציבה ואת שלב ההתפתחותי של עניין. הערה: יש הבדל בין צמיחה היציבה וצמיחה חוזרת, מה שמרמז תבניות המרחביות דומות על עלים רצופים על אותו ציר. במהלך השלבים המוקדמים של צמיחת שתיל, עלים רצופים בדרך כלל גדלים יותר ויותר מהר בגלל הגודל הגובר של אזור צמיחת 7. למרות כמה תפקידים עלה גבוה יכול להיות דפוס צמיחה דומה 8, זהו שלב חולף העשויים להיות מושפעים על ידי טיפולים תחת חקירה. לכן חשוב להשוות קווי tr<html> eatments ורק על העמדה עלה אותו, למרות שזה ניתן לפתח בזמן אחר. אפילו בקצב התארכות מתמיד, פרופיל שיעור הצמיחה אינו בהכרח זהה בשלבי התפתחותיים שונים. לכן, חשוב לנתח העלים באותו שלב התפתחותי 8, בדרך כלל מוגדר במספר ימים לאחר הופעתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע ניתוח kinematic מלא צמיחה עלה ב monocots, לגדול לפחות 15 צמחים עבור כל טיפול ו גנוטיפ בתנאים מבוקרים בחדר צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו הזמן העלה של עניין מופיע (הופעתה מן במערבולת של עלים שמסביב), להתחיל למדוד את האורך של העלה יומי עם סרגל עד העלה מורחב מלא (האיור 1i). אורך ליף מרמז על אורך מרמה הקרקע עד קצה העלה. היזהר שלא לשבור או לפגוע עלה, כיוון שזה עלול לשנות את צמיחתה. </li></ol>בתשובה לשאלה 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1:. סקירה סכמטי של ניתוח kinematic עלי תירס העלה של ריבית נמדד עם שליט במשך שלושה ימים רצופים כדי לחשב את שיעור ההתארכות ליף (הימלר). לאחר מכן, העלה שנקטף וקטע שלושה סנטימטר משמש לקביעת גודל meristem. הדבר נעשה על ידי מדידת אורך מהבסיס עד הדמות mitotic הדיסטלי ביותר לאחר מכתים DAPI. (א) דוגמאות של דמויות mitotic שגשוג ו (ב) דמויות mitotic מכוננות. אחד עשרה הסנטימטרים הראשונים מהבסיס עלה בצד השני של הווריד באמצע משמשים לחתוך עשרה קטעים חד-סנטימטר למדידות אורך תא. מדידות אלה מספקים את הבסיס ליצירת פרופיל אורך התא, המשמש כדי לקבוע את אורך התא הבוגר (מחצלת l) ואורך תאים עוזב את meristem (div l). ה <em&gt; הימלר מחצלת l משמשים לחישוב שיעור ייצור תאים (P), בעוד div L ו- L mer משמשים כדי לחשב את מספר התאים meristem (N mer). בתורו, P ו- N mer משמשים לחישוב שיעור חלוקת התא הממוצע (D), שהוא ההופכי של משך מחזור התא (ג T). חצים של אותו הצבע עולים פרמטרים המשמשים לחישוב הפרמטר הבא על החצים האלה. ברי סולם = 40 מיקרומטר. מספרים רומים משמשים להתייחס להליכים ספציפיים ניסיוני כמתואר בפרוטוקול. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> קציר 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב ההתפתחותי של עניין (למשל, ביום השלישי לאחר הופעתה), לבחור לפחות חמש p נציגlants מהאצווה שעליו לנהל את ניתוח kinematic. המשך מדידת שאר הצמחים כמוסבר בשלב 1.3 כדי לקבוע את אורך הדף האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלק מעל הקרקע של המפעל. כדי לשמור על חלק meristematic שלם, לחתוך קרוב ככל האפשר אל השורשים (איור 1ii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל העלים החיצוניים, להסיר את כל העלים עד העלה עניין ידי unrolling אותם אחד בעדינות על ידי אחד. במידת צורך, להסיר כמה מילימטרים נוספים מהבסיס לנתק את העלים. כמו כן להסיר את עלי איפקס קטנים וסגורים על ידי עלה העניין (איור 1iii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים מקטע 3 ס&quot;מ, החל מבסיס בצד אחד של וריד באמצע, ולאחסן אותו צינור 1.5 מ&quot;ל מבחן מלא 3: 1 (v: v) אתנול אבסולוטי: פתרון חומצה אצטית (זהירות: ללבוש כפפות) ב 4 ° C. במשך 24 שעות עד מספר חודשים (איור 1iv). קטע זה ישמש מאוחר יותר כדי לקבוע את האורך של meristem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ הבצד השני של הווריד, לחתוך קטע 11 ס&quot;מ מבסיס (איור 1 נ) ולמקם אותו בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל מלא אתנול אבסולוטי ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 שעות כדי להסיר פיגמנטים (איור 1 vi). הערה: בהמשך, השתמשו רק 10 הסנטימטרים הראשונים כדי לקבוע את פרופיל אורך תא (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדשו את אתנול אבסולוטי לסיבוב נוסף של ניקוי על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות (איור 1vi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להחליף את אתנול האבסולוטי עם חומצה לקטית טהורה (זהירות: ללבוש כפפות) לניקוי ואחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות או עד לשימוש נוסף (איור 1vi). </li></ol> 3. מדידות אורך meristem <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ שטיפה המכילים נתרן כלורי 50 מ&quot;מ (NaCl), 5 מ&quot;מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA; זהירות: ללבוש כפפות) ו -10 מ&quot;מ טריס (hydroxymethyl) חומצה aminomethane-הידרוכלורית (טריס-HCl; pH 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את קטע 3 ס&quot;מ בסעיף 2.4 וכן הלאהAK אותו למאגר במשך 20 דקות (איור 1vii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, להשתמש חיץ שטיפה להכין פתרון מכתים 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, שמירה על אותה על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הגרעינים ידי צבת במגזר meristem במשך 2-5 דקות בתמיסה המכתימה DAPI. עבודה על הקרח בחושך (איור 1vii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו אותות קרינה על ידי הרכבה במגזר במהירות על כוס מיקרוסקופיה והמריחה עם מכסה זכוכית. תאי אפידרמיס צריכים להראות קרינה, בעוד שכבות תאי הבסיס לא צריכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המכתים אינו מספיק, לשים במגזר בחזרה הפתרון המכתים DAPI עבור כמה דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את המכתים, הר המגזרים בטיפת שטיפת חיץ בשקופית מיקרוסקופיה ומכסה כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוסקופ מצויד קרינת UV בהגדלת 20X, המאפשר הדמיה של כ -1,000 epidermאל תאים בבת אחת. גלול לאורך קטע ולחפש דמויות mitotic שגשוג (metaphase, anaphase, telophase, ו cytokinesis), אך להימנע חלוקת התא המכונן של (1viii איור) בפיתוח הפיוניות 9. גדר שם דמות mitotic הדיסטלי ביותר ממוקמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אורך meristem על ידי מדידת המרחק בין הבסיס של העלה והדמות mitotic ביותר דיסטלי אפידרמיס. השתמש תמונות תוכנה לניתוח (למשל, ImageJ) כדי למדוד את אורכו של מסגרת התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר המסגרות שמכסות את אורך meristem המלא (מהבסיס עלה לנתון mitotic הדיסטלי ביותר) ו להכפיל את המספר הזה לפי אורך מסגרת אחת כדי לקבל את אורך meristem המלא (1ix איור). </li></ol></li></ol> 4. פרופיל אורך תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח במגזר המאוחסן חומצה לקטית (שלב 2.5) ולמקם אותו בזהירות על הספסל. חותכים את השנינות מגזריםחה אזמל ב 10 מקטעים של 1 ס&quot;מ כל אחת (איור 1x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המגזרים עלו הרצופים בשקופית מיקרוסקופ ב טיפה קטנה של חומצה לקטית. הקפד להתמודד באופן עקבי גם את adaxial או למעלה בצד abaxial. באופן עקרוני, אין העדפת צד מסוים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוסקופ מצויד התערבות הפרש לעומת זאת אופטיקה (DIC) לנתח את המגזרים, החל מבסיס העלה. מדוד עם תוכנת ניתוח התמונה אורך תאי אפידרמיס לשכפל 20 לפחות ב קבצים סמוכים ישירות לקבצי הפיוניות על מנת לבחור את סוג התא אותו בעקביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם זה על עמדות ברווחים שווים לאורך אחד ממגזרי (4 עמדות לכל להספיק קטע), ולוודא כדי לרשום את המיקום המתאים לכל מדידה לאורך (1xi איור) עלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אורך התא הממוצע בכל מ&quot;מ לאורך הציר עלה באמצעות p חלקת פולינום מקומיrocedure, ויושם R-סקריפט (איור 1xii; קובץ משלים 1). הערה: The-סקריפט R מספק סדרה של נתונים עם הגדלת חלקה. כמות החלקה הנדרשת היא שרירותית ו אידיאלי צריך רק להסיר את הרעש המקומי, אך לא להשפיע על עקומת הכולל. הקפד להשתמש באותה כמות של החלקה עבור כל הדגימות בתוך בניסוי אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע אורך תא במיקום כל בין צמחים ובעלי לחשב את סטיית התקן ליצור פרופיל אורך התא לאורך ציר עלה. </li></ol> 5. חישובים של פרמטרים קינמטית (ראה משלים קובץ 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הימלר על ידי לקיחת השינוי באורך עלה בין שתי נקודות זמן רצופות (למשל, 24 שעות, כמו בשלב 1.3) וחלוקתו את מרווח הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את אורך צמיחת האזור (GZ L) המתאים דיסטלי עמד מהבסיס שבו תאים מגיעים 95% של ce הבוגרת שלהםאורך ll על פרופיל אורך תא smoothened. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח לכל עמדה על% 95 פרופיל אורך תא smoothened של הממוצע של כל אורכי התא הבאים עמדה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת אורכי תא smoothened (שלב 4.4) עם אורך תא מחושב 95% בכל אחת מעמדות. החל מהבסיס של העלה, אזור הגידול ומסתיים במצב שבו אורך התא בפועל שווה 95% של אורכי התא הבאים (איור 2; לראות משלי נתונים 2). </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> איור 2:. קביעת מועד לסיום לאזור הצמיחה meristem: במיקום מצוין עם כוכב אדום, גודל התא בפועל הוא קטן מ -95% (קו מקווקו אדום) של גודל התא הממוצע של כל התאים הבאים עמדה זו (אדום מוצק קַו). סופו של אזור הגידול (GZ L; מצוין עם ablue כוכב) ממוקם שבו 95% (קו כחול מנוקד) של גודל התא הממוצע של כל התאים הבאים עמדה זו (הקו הכחול מוצק) שווה לגודל התא בפועל. אגף אזור (D), אזור התארכות (E), ואת האזור הבוגר (M). חצים המקווקווים מציינים ההתכנסות בין הגודל המקומי ו -95% ביחס לגודל הממוצע על החלק הדיסטלי של העלה בעת מעבר מהעמדות הבסיסיות אל קצה העלה. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את אורך אזור התארכות (L אל) כהפרש בין אורך של אזור הגידול (GZ L) ואת גודל meristem (L mer; נקבע בשלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את אורך התא הבוגר (מחצלת l) כמו אורך תא הממוצע באזור הבוגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הימלר ידי מחצלת l כדי להשיג אתשיעור ייצור תאים (P). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר התאים באזור התארכות (N אל) כהפרש בין GZ N ו- N mer. מספר תאי meristem (mer N) שווה למספר המצטבר של תאים הממוקמים במרווחים המתאימים meristem. מספר תאים באזור צמיחה (GZ N) שווה למספר המצטבר של תאים הממוקמים במרווחים החופף את אזור הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את קצב חלוקת התא הממוצע (ד) כפי mer P / N. משך מחזור התא (ג T) שווה ln (2) / D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הזמן באזור ההתארכות (T אל) על ידי חלוקת N אל ידי P. השעה באזור חלוקה שווה log 2 (mer N) * ג T. אורכו של תאים עוזב את meristem (div l)שווה אורך תא מהפרופיל אורך תא smoothened בסוף של meristem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את קצב התפשטות תאים הממוצע (R אל) באמצעות הנוסחה הבאה: ln (מחצלת l) -ln (div l)] / T אל. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ניתוח kinematic מלא על עלי תירס מאפשר קביעת הבסיס הסלולר של צמיחה עלה ומאפשר את העיצוב של אסטרטגיות דגימה יעילות. אף על פי הפרוטוקול הוא פשוט יחסית, קצת זהירות מומלצת השלבים הקריטיים הבאים: (1) חשוב לנתק את העלים הצעירים, סגורים (שלב 2.3) מבלי לפגוע meristem, מאז קביעת אורך meristem (שלב 3) מחייב המלא meristem להיות נוכחת. חלק באימון לפני כן ייתכן שיש צורך. (2) קביעת אורך Meristematic מבוססת על פרשנות של דמויות mitotic. לכן, אנו ממליצים כי, בתוך בניסוי אחד, אותו אדם מקיים מדידות אלה כדי להפחית את השונות בשל לפועל. (3) למרות שרק עשרה סנטימטרים משמשים עבור מדידות אורך תא בפועל, חשוב לכלול עשרה סנטימטרים כאשר קצירה במגזר למדידות אורך תא (שלב 2.5), כי הקצה במגזר עושה שוםלא תמיד מלא להטביע באתנול ו / או חומצה לקטית. לכן, סנטימטר נוסף זה מבטיח סליקת העשרה הסנטימטרים הראשונים של אזור הגידול. (4) בסופו של דבר, כדאי לבדוק את התוצאה של כל הפרמטרים קינמטיקה כדי לוודא שהם נכונים. בלוח 3, למשל, קצב ההפקה תא (P) של צמחים-הדגיש הבצורת הוקטנה 71%, או, במילים אחרות, הבצורת P הוא 0.29 השליטה P. מאז ייצור התאים תלוי בשיעור חלוקת תא ממוצע (D; -63%) ואת מספר תאי meristem (N mer; -20%; איור 3), את הדברים הבאים יכולים לשמש כדי לאמת את הפלט: P (0.29) ≈ N mer (0.8) x D (0.37). אותו ניתן ליישם עבור מחצלת לי x הימלר = P. בהתאם מהתקנים הזמינים, הפרוטוקול ניתן לשנות בצעדים מסוימים. (1) יותרחלופת dvanced עבור מדידות אורך עלה היומיות הידניות (בשלב 1.3) מבוססת על מתמר תזוזה לינארית Velocity (LVDTs) 13. היתרון בכך שהיא מאפשרת מדידות ברזולוצית זמן הרבה יותר גבוהה, נעה בין כמה דקות לשניות. (2) זה חיוני לכלול את אזור צמיחה המלא במהלך דגימה. עם זאת, תנאים סביבתיים, גנוטיפ, מינים, ואת השלב ההתפתחותי בחן עשוי לשנות את אורכו של אזור הגידול. לכן, כדאי לעשות ערכה ראשונה של האורך של אזור גידול תגובה לטיפול הניסוי שלך. פרוטוקול זה מבוסס על הקו הטהור B73 גדל ב 25 ° C / 18 ° C (יום / לילה) בשעה 300-400 μEm -2 s -1 (קרינת Active פוטוסינתזה - PAR). (3) על מנת להמחיש את דמויות mitotic (שלב 3.8) מבלי להשתמש קרינה, כתם Fuelgen ניתן ליישם 14. (4) החלקה של הנתונים יכול להיעשות גם ב- MS Excel במקום R באמצעות קואה חמש נקודותdratic הולם עם הפונקציה &quot;LINEST&quot; 15. מגבלה חשובה של טכניקה זו היא כי אזור הגידול כולו צריכה להיות שנקטף במהלך הצמיחה יציבה. על מנת להבטיח צמיחה יציבה, צמחים אידיאליים חייבים להיות מבוגרים בתנאי גידול מבוקרים, כי התנודות עוצמות אור, טמפרטורה, לחות או להשפיע על שער ההתארכות עלה 16. מסיבה זו, ניתוח קינמטיקה הוא פחות מתאים צמחים הגדלים בתנאי שדה. חיסרון נוסף הוא כי העלים צריכים להיות הגיח, מה שהופך את זה בלתי אפשרי לבחון עלים שעדיין מוקפת עלים מבוגרים. לבסוף, הפרוטוקול מתאים מיני monocotyledonous עם אזורי צמיחה גדולים המקיפים לפחות כמה סנטימטרים. ניתוח kinematic על monocots קטן (למשל, פואה, אורז), לעומת זאת, אינו ריאלי אבל צריך קצת שינויים בהכנת מדגם 17,18. עוד מרבה להשתמשד גישה לנתח פנוטיפים צמיחת הפרש הוא ניתוח צפי גידול הקלסי. ניתוח זה מכמת שיעורי צמיחה יחסיים כולה צמח וקובע ההקצאה הבסיסית של פחמן פוטוסינתטיים נגזר לאזור פוטוסינתטיים חדש לחלקים אחרים של הצמח 19. הניתוח קינמטיקה, לעומת זאת, מאפשר הבנה מפורטת יותר של תהליכים תאיים שבבסיס כי הם מצמידים את פנוטיפים צמיחה בהתבסס על לכימות חלוקת התא והתרחבות. יתר על כן, האפשרות לקבוע את משך הזמן של כל אזור צמיחה מאפשרת המתאם של מדידות מולקולריות לאורך הציר עלה לשלב ההתפתחותי הספציפי מושפע הטיפול נחקר. זה קריטי עבור נתונים לפרשנות. כאשר מוגבל בזמן או תקציב או כאשר מעוניינים בשלבים התפתחותיים ספציפיים, התוצאה של ניתוח זה מאפשר דגימה ממוקדת, צמצום מספר דגימות הנדרש לניתוח. לסיכום, ניתוח kinematic לאפשרזה קביעת הפרמטרים הסלולר הבסיסיים תגובות דחק וריאציה גנטית בצמיחה עלה יכול לקשר אותם במעלה זרם תהליכים רגולטוריים (טבלה 2).

ניתוח צמיחה תלוי סט של כלים המשמשים בדרך כלל על ידי מדעני צמח לתאר הבדלי צמיחה ו / או תשובות פנוטיפי נקבע גנוטיפ לגורמים סביבתיים. הם כוללים מדידות גודל ומשקל של הצמח כולו או איבר וחישובי שיעורי צמיחה לחקור את המנגנונים של צמיחה. צמיחת איברים נקבעת על ידי חלוקת תא והרחיב ברמה התאית. לכן, כולל הכימות של שני תהליכים אלו בצמיחת המנתח הוא מפתח להבנת הבדלים בצמיחה כולו באיברי 1. כתוצאה מכך, חשוב להיות בעל במתודולוגיה לקבוע פרמטרי צמיחה הסלולר כי הוא יחסית קל לשימוש על ידי מעבדות ללא התמחות. ניתוח קינמטית כבר קמה, כגישה מתן מסגרת רבת עוצמה לפיתוח מודלים של גידול איברים 2. הטכניקה כבר אופטימיזציה עבור מערכות לינאריות,כמו שורשי ארבידופסיס thaliana ועלי monocotyledonous, אלא גם למערכות שאינן ליניארי, כגון עלי dicotyledonous 3. כיום, מתודולוגיה זו נמצאת בשימוש יותר ויותר כדי ללמוד איך גנטי, הורמונלית, התפתחותיים, וגורמים סביבתיים משפיעים חלוקת תא והרחיב באיברים שונים (טבלה 1). יתר על כן, הוא גם מספק מסגרת לקשר תהליכים תאיים לתקנות ביוכימיים, מולקולריות, ופיזיולוגיים הבסיסיות שלהם (טבלה 2), למרות מגבלות שניתן להטיל לפי גודל איבר וארגון מרחבי טכניקות הדורשות כמויות גדולות יותר של חומר צמחי (למשל, המטבוליט מדידות, פרוטאומיקה, וכו &#39;). עלי Monocotyledonous, כגון התירס (Zea Mays) עלה, מייצגים מערכות ליניאריות שבו תאים להעביר מהבסיס של העלה כלפי הקצה, ברצף עוברים דרך אזור meristem ואת ההתארכות להגיע הבוגרתאֵזוֹר. זה עושה את זה מערכת מודל אידיאלית עבור מחקרים כמותיים של התבניות המרחביות של צמיחה 4. יתר על כן, עלי תירס יש אזורי צמיחה גדולים (meristem אזור התארכות פורשים כמה סנטימטרים 5) ולספק אפשרויות ללימודים ברמות ארגוניות אחרות. זה מאפשר חקירת מנגנוני הוויסות (המשוערים) שליטת חלוקת תא ורחב, לכמת ידי ניתוח kinematic באמצעות מגוון של שיטות מולקולריות, מדידות פיסיולוגיות, וגישות ביולוגיה של תא (טבלה 2). כאן, אנו מספקים פרוטוקול לביצוע ניתוח kinematic בעלי monocot. ראשית, נסביר כיצד לבצע ניתוח נכון של שני חלוקת התא ואת התארכות התא כפונקציה של המיקום לאורך ציר עלה וכיצד לחשב פרמטרים קינמטיקה. שנית, אנחנו גם להראות איך זה יכול לשמש כבסיס לעיצוב דגימה. כאן, אנו דנים בשני מקרים: דגימה ברזולוציה גבוהה<html> ד ממוקד דגימה, המאפשר פרשנות נתונים משופרות ולחיסכון בזמן / כסף, בהתאמה. סקירת טבלת 1. קינמטיקה מנתח שיטות כימות של חלוקת תא והרחבה באיברים שונים. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אֵיבָר </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td> עלי monocotyledonous </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> טיפים שורש </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> עלי dicotyledonous </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> לירות meristem הפסגה </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> סקירת טבלת 1. קינמטיקה מנתח שיטות כימות של חלוקת תא והרחבה באיברים שונים. ther.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54887/54887table2.jpg" /> קישור טבלה 2. בין תהליכים תאיים לכמת ידי ניתוח kinematic לרגולציה שלהם ברמה המולקולרית. הפניות למחקרים שונים מקשרים כימות של תהליכים תאיים לתוצאות מבחני ביוכימיים ומולקולריים במינים ואיברים שונים. Endotransglucosylase Xyloglucan (XET), malondialdehyde (מד&quot;א), קינאזות תלויות-ציקלין (CDK). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הטבלה.</a>

<table><tbody><tr><td>Pots</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.</td></tr><tr><td>Planting substrate</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Any</td><td>Any</td><td>An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.</td></tr><tr><td>Seeds</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Seeds can be ordered from a breeder.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL falcon tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.</td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Latex gloves, which protect against corrosive reagents.</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion</td></tr><tr><td>Lactic acid&amp;nbsp;&gt;98%</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity &amp;ndash; Single exposure, category 3</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidine-2&amp;prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Ice</td><td>Any</td><td>NA</td><td>The DAPI solution has to be kept on ice.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td><td></td><td>Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.</td></tr><tr><td>Microscopic slide</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Image-analysis software</td><td>Axiovision (Release 4.8) from Zeiss</td><td>NA</td><td>The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.</td></tr><tr><td>Microscope equipped with DIC</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other</td><td></td><td>Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.</td></tr><tr><td>R statistical analysis software</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>R script</td><td>NA</td><td>NA</td><td>We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.&amp;nbsp; Kernel Smoothing: Chapman &amp;amp; Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.</td></tr></tbody></table>

kinematic analysis of cell division and expansion: quantifying the cellular basis of growth and sampling developmental zones in zea mays leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

הנה, אנחנו מראים השוואה בין צמחים מושקים (שליטה, 54% תכולת מים בקרקע, (SWC)) וצמחים נתונים בתנאי עקת בצורת (בצורת, 34% SWC) במונחים של צמיחת העלה שלהם. כל הצמחים גדלו בתא צמיחה בתנאים מבוקרים (16 שעות ביום / 8 שעות בלילה, 25 ° C / 18 ° C יום / לילה, 300-400 μEm -2 שניות -1 photosynthetically הקרינה פעילה (PAR). תנאי הבצורת הוקמו על ידי מניעת מים עד הנכון SWC הושג ולאחר מכן עוד נשמר. במחקר ראשוני, הוא הוגדר כי עלה החמישי הוא אחד הראשונים מתעוררים ומתפתחים בתנאי הלחץ הזה. לכן, נבחר עלה של הריבית. שהאורך ליף הסופי (LL) של הצמחים-הדגיש בצורת הייתה 40% נמוכה יותר מזו של הצמחים להשקות היטב, אשר נבע הימלר נמוך (לוח 3). כדי להבין את הבסיס התאי של לאהבתגובה צמיחה f, ביצענו ניתוח kinematic. בסך הכל, שיעור התארכות עלה הוא פונקציה של ייצור תא meristem וגודל תא בוגר שנקבע אזור ההתארכות (איור 3). לכן, הקיצור של העלה חייב להיות בשל השפעות על אחד או שני פרמטרים אלה. התוצאות שלנו מראות כי בעוד אורך התא הבוגר (מחצלת יב) לא נפגע, קצב הפקת תא (P) הופחת ב -71% (לוח 3). מחצלת l תלויה באורך של התאים עוזבים את meristem (div l) , הזמן התאים האלה מבלים באזור התארכות (T אל), ושיעור הרחבת התא יחסית (R אל). אין השפעה נצפתה div l, בעוד R אל הופחת ב -67% בתנאי יובש. השפעה זו פוצתה כמעט שולש T אל, אשר הביא את המחצלת באותו l &lt;/ Sub&gt; כמו את תנאי השליטה. הקיטון בשיעור ייצור תאים היה, בתורו, גרם הוא בשיעור חלוקת תא ממוצע נמוך יותר (D) ויש עוד מספר קטן של תאי meristem (mer N). אורך meristem (L mer) הופחת בניגוד אורך אזור הגידול (GZ L), אשר לא הושפע באופן משמעותי. לסיכום, תוצאות אלו מראות כי במקרה זה, מספר תאים, בניגוד גודל תא, היה תפקיד מרכזי בקביעת גודל עלה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פרמטרים קינמטית </td><td> C </td><td> D </td><td> CD שינוי% </td><td> p-value </td></tr><tr><td> LL </td><td> 727 ± 15 </td><td> 436 ± 23 </td><td> -40 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> הימלר (מ&quot;מ / שעה) </td><td> 2.8 ± 0.1 </td><td> 0.8 ± 0.0 </td><td> -73 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> מחצלת l (מיקרומטר) </td><td> 140 ± 3 </td><td> 130 ± 6 </td><td> -7 </td><td> NS </td></tr><tr><td> P (תאים / h) </td><td> 20 ± 1 </td><td> 6 ± 0 </td><td> -71 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> D (תאים · תא -1 · -1 hr) </td><td> 0.028 ± 0.003 </td><td> 0.010 ± 0.001 </td><td> -63 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> ג T (HR) </td><td> 26 ± 3 </td><td> 71 ± 7 </td><td> 173 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> Div T (HR) </td><td> 249 ± 27 </td><td> 656 ± 71 </td><td> 164 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> L mer (מ&quot;מ) </td><td> 15 ± 1 </td><td> 11 ± 1 </td><td> -25 </td><td> 0.010 </td></tr><tr><td> N mer </td><td> 740 ± 31 </td><td> 590 + 20 </td><td> -20 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> R el (מיקרומטר · מיקרומטר <sup&gt; -1 · hr -1) </td><td> 0.043 ± 0.002 </td><td> 0.014 ± 0.001 </td><td> -67 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> div l (מיקרומטר) </td><td> 24 ± 2 </td><td> 23 ± 2 </td><td> -4 </td><td> NS </td></tr><tr><td> T אל (HR) </td><td> 42 ± 2 </td><td> 125 ± 11 </td><td> 199 </td><td> 0.000 </td></tr><tr><td> N אל </td><td> 844 ± 54 </td><td> 735 ± 65 </td><td> -13 </td><td> NS </td></tr><tr><td> L ז z (מ&quot;מ) </td><td> 68 ± 1 </td><td> 61 ± 5 </td><td> -11 </td><td> NS </td></tr><tr><td> N ז z </td><td> 1584 ± 33 </td><td> 1326 ± 66 </td><td> -16 </td><td> 0.010 </td></tr></tbody></table> לוח 3. ניתוח קינמטית על חלוקת תאי הרחבת תא במהלך הצמיחה היציבה של העלה החמישי. צמחים וצמחי היטב להשקות נתון הבצורת מתח הנתונים הנם ממוצעים ± SE (n = 5 עבור LL: n = 10). מבחן t שימש ניתוח סטטיסטי. פרמטרים: אורך עלה (LL), שיעור התארכות עלה (הימלר), אורך תא בוגר (מחצלת l), קצב ההפקה תא (P), שיעור חלוקת התא (ד), משך מחזור התא (ג T), משך האימון בטווח החלוקה ( T div), אורכו של meristem (mer L), מספר תאים meristem (N mer), שיעור התארכות התא יחסית (R אל), אורכו של תאים עוזב את meristem (div l), זמן באזור התארכות (T אל), מספר התאים באזור ההתארכות (N אל), אורכו של אזור הגידול (GZ L), מספר התאים באזור הצמיחה (GZ N), תנאים-להשקות היטב (C), מתח בצורת ( D), גידול<html> ד לא משמעותי (NS). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig3.jpg" /> איור 3:. קשר בין פרמטרי קינמטיקה אורכו העלה הסופי (LL) תלוי בשיעור ההתארכות ליף (הימלר), אשר בתורו תלוי ייצור התאים (P) ואורך תא בוגר (מחצלת l). מספר התאים meristem (mer N) והמחיר חלוקת התא (ד) יחד לקבוע P, עם (ג T) משך מחזור התא כמו ההופכי של D. זמן באזור התארכות (T אל), אורך של תאים עוזב את meristem (div l), ושיעור הרחבת התא יחסית (R el) לקבוע את אורך התא הבוגר (מחצלת l). מספר התאים באזור ההתארכות (N אל)..jove.com / קבצים / ftp_upload / 54,887 / 54887fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בנוסף היישום שלה כמו ניתוח מפורט של צמיחה איברים, ניתוח kinematic מספק מפה של לוקליזציה אזור עלה צמיחה מאפשר דגימה עם רזולוציה subzonal עבור מולקולרית ביוכימיים מנתח 4,10,11. כדוגמה, איור 4 א מראה malondialdehyde (מד&quot;א) כימות לאורך אזור הצמיחה של העלה תירס בצמחים נתון באותם תנאים כמו לעיל. מד&quot;א הוא מטבוליט משני נוצרו במהלך חמצון של שומנים על ידי ROS ומשקף את רמות של נזק חמצוני 12. מד&quot;א נמדד בכל סנטימטר של העלה, החל מבסיסו, אשר אפשר ניתוח של שינויי ריכוז לאורך שיפוע הצמיחה 11. כטיפול הבצורת גרמה לקיצור עלה 40%, אורכו של אזורי התפתחותית (Meriגזע, אזור התארכות, אזור המבוגר) במפעלי הביקורת לא להתאים את האורך הזהים האזורים ב הבצורת הדגישה צמחים (איור 4B). כפי שניתן לראות באיור 4B, את meristem במפעלי המלא היה ארוך כ -1.5 סנטימטר, ואת אזור ההתארכות והקיף מ 1.5 כדי 6.8 סנטימטרים מבסיס העלה. בשאר המפעלים הדגיש, את meristem היה מקומי מן 0 כדי 1.1 ס&quot;מ ואת אזור התארכות מן 1.1 כדי 6.1 ס&quot;מ. רמות מד&quot;א אזור הגידול כולו הוגדלו בצמחים-הדגיש בצורת בהשוואה לטיפול ביקורת. בעזרת ניתוח קינמטיקה, נוכל להסיק כי תוכן מד&quot;א הוגדל במיוחד באזור הבוגר לשני טיפולים מלאי בצורת. בלי לדעת את הגדלים של אזורי התפתחותית, היינו מסיק כי, תחת לחץ בצורת, מגדילת תוכן מד&quot;א שלב התפתחותי מוקדם יותר מאשר הצמחים השליטים, וזה לא תהיה בסדר כפי שהוא אינו לוקח בחשבון את ההסטה של ​​האזורים בשל ל- tהוא קיצור עלה. לכן, ביצוע ניתוח kinematic לפני מדידות ביוכימיים היה חשיבות מכרעת על מנת לפרש את הנתונים בצורה נכונה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig4.jpg" /> איור 4: דוגמא של מדידות ביוכימיות ברזולוציה גבוהה דגימה לניתוח ממוקד (א) Malonaldehyde ריכוזים (מד&quot;א) נמדדו לאורך אזור הצמיחה עלה תירס (מחולק לעשרה קטעים) של צמחים הגדלים במצב רווי מים וצמחים נתונים בצורת. טיפול 10. הנתונים הם ממוצעים ± SE (n = 5). דו כיוונית ANOVA שימש ניתוח סטטיסטי, ו- p-הערכים מוצגים ליד לוח גרף (גורמים: הבצורת (ד) מגזר (ים)); FW: משקל טרי. (ב) ויזואליזציה של אזורי הגידול השונים בשליטה וצמחים-הדגיש בצורת. אגף אזור (D), אזור התארכות (E), ואזור בוגר (M). תאים מוגדלים 125 פעמים. (C) תא באורך פרופיל שליטה וצמחים שטופל בצורת. הנתונים הם ממוצעים ± SE (n = 5). הבדלים (D) ב דגימה ממוקדת בשני מלא צמחים שטופל בצורת. את הקופסות הכחולות מציינות את מיקום דגימה להשוות אותה לשלב ההתפתחותי בשני הטיפולים. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54887/54887fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בנוסף מתן האפשרות להשוות אותה אזורי התפתחותיות במחקרים ברזולוציה גבוהה, ניתוח kinematic יכול לשמש גם כבסיס ניתוחים ממוקדים יותר, שבו רק דגימות של אזורים ספציפיים המכילים תאים באותו שלב התפתחותי נלקחות. השווינו את פרופילי אורך תא, שמספקים החלקה של מדידות אורך תא המיקרוסקופיות, בעשרה ג הראשוןentimeters מבסיס העלה של מלאת צמחים-הדגיש בצורת. איור 4C מראה כי, באמצעות פרופיל אורך תא, נוכל לקבוע את האורך של אזורי התפתחותיים גם יכולים לעקוב אחר דינמיקת קצב הצמיחה היא בשליטה וצמחים-הדגיש בצורת. זה אפשר דגימה ספציפית של מתרבי תאי meristem (לפני העלייה החדה), הרחבת תאים באזור ההתארכות (באמצע העלייה החדה) ותאי בוגרת צעיר באזור הבוגר (תחילת הרמה). התוצאות שלנו מראות כי, בשל הקיצור עלה בתגובת הבצורת, באזורים אלה לא מתאימים בבקרה וב הצמחים הדגישו. על מנת לדגום מתרבים, מתרחב, תאי בוגרים צעירים בצמחים שליטים, אנו זקוקים הראשון, חמישי, ו הסנטימטר תשיעי מבסיס העלה, בהתאמה. עם זאת, ב הצמחים הדגישו, מקטעים אלה מתאימים הסנטימטר הראשון, רביעי, והשמיני בהתאמה. סוג זה של יותר ממוקדהדגימה הוכיחה להיות שימושי במקרה של מייגע יותר, יקר, או זמן רב מחקרים, כגון רצף RNA, פרוטאומיקה, metabolomics, וכו &#39; קובץ 1 משלים:. R-סקריפט עבור החלקת פולינום <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54887/Supplementary_Data_1.docx" target="_blank">אנא לחץ על זכות להוריד את הקובץ.</a> קובץ 2 משלים:. חישובים של פרמטרים קינמטיקה <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54887/Supplementary_Data_2.xlsx" target="_blank">אנא לחצו על זכות להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves at JoVE.com

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה<em&gt; Zea Mays</em&gt; מותיר

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

kinematic-analysis-cell-division-expansion-quantifying-cellular-basis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

10.8K Views.  University of Antwerp. Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies. 

Video: Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Biochemistry

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Developmental Biology

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in indentation mode, we show how to measure an elastic modulus and use it to evaluate cell wall mechanical properties. In addition, we also explain how to evaluate turgor pressure. The main advantages of atomic force microscopy are that it is non-invasive, relatively rapid (5~20 min), and that virtually any type of living plant tissue that is superficially flat can be analyzed without the need for treatment. The resolution can be very good, depending on the tip size and on the number of measurements per unit area. One limitation of this method is that it only gives direct access to the superficial cell layer.

Here, we present atomic force microscopy (AFM), operated as a nano- and micro-indentation tool on cells and tissues. The instrument allows the simultaneous acquisition of 3D surface topography of the sample and its mechanical properties, including cell wall Young's modulus as well as turgor pressure.

שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Bioengineering

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video