Name: zika virus infectious cell culture system and the in vitro prophylactic effect of interferons
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons at JoVE.com

We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

הערה: מתאר סכמטי של זרימת העבודה מוצג באיור 1. 1. תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאי Vero לייצור וירוס זיקה וניתוח של מחזור שכפול נגיפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת צמיחה מלאה המכילה 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, פניצילין (100 יחידות / מ&quot;ל), סטרפטומיצין (100 יחידות / מ&quot;ל), ו -10 מ&quot;מ HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי Vero עם מדיום הגידול להשלים שצוין על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol> 2. הפקת וירוס Zika <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי Vero ב 80% צפיפות תאים באמצעות טריפסין 0.25% ב בקבוק T-75 לספור את התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת מהבקבוק תרבות T-75 ולשטוף את התאים עם 2 מ&quot;ל בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של טריפסין 0.25% ו דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מ&quot;ל של סרום המכיל מדיום הגידול כדי להשבית טריפסין. Pipet מעלה ומטה כדי susתאים pend ולהעביר את התאים צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μl של תאים ומערבבים עם כמות שווה של כחול 0.4% trypan. טען את התערובת המוכנה השקופית הקאמרית ספירת תאים ולקבל תא קיימא ספירה באמצעות דלפק תא אוטומטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים סך של 7 מיליון תאים בנפח 30 מ&quot;ל לתוך בקבוק T-160. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להכין ריבוי המתאים של זיהום (0.01 כדי 0.1 משרד הפנים) של הבידוד וירוס Zika בתוך התקשורת והתרבות חינם 10 מ&quot;ל סרום לכל בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה בילה מהבקבוק T-160 ולאחר מכן להוסיף את הבידוד ויראלי מוכן טרי (10 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלוחיות המחוסנות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 4-6 שעות. מורחים את הבידוד על ידי הטיית צלוחיות בעדינות הצידה בכל שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום הדגירה, להחליף את הבידוד עם תקשורת צמיחת סרום בתוספת חמה (30 מיליליטר) עבור כל בקבוק. ואז להמשיך את התרבות הנגיף למשך 96 שעות הקרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההתקדמות בfection על ידי התבוננות במראה של רובד נגיפי על monolayer התא באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב ולקחת תמונות (איור 2) על פי הצורך בהגדלה 40X ו 200X. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> איור 2:. הפלאק נוצר על ידי וירוס Zika על monolayer של תאי Vero תמונות שדה מוארות של בהגדלה שונה מראות רובד נגיפי זיקה ב -48 HPI. הערת הנוכחות של מוקדי תאים מעוגלים על monolayer. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants תרבית תאים קציר בנקודת 96 שעות זמן בצנטריפוגה supernatant XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant מבלי פסולת pelleted מטריד והעברת to 15 מ&quot;ל צינורות. Ultracentrifugation ב 24,000 XG יכול להתבצע להתרכז חלקיקים נגיפיים (אופציונלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את supernatants תרבות ויראלי aliquots המרובה ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. כייל הנגיף Zika מדידת ידי assay פלאק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל היטב 2 מ&quot;ל נפח באמצעות צלחת 12-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להכין פי 10 דילולים סידוריים של supernatants התרבות ויראלי שנאסף מבקבוק T-160 באמצעות סרום ללא מדיה. הסר את המדיה בילתה מבאר כל ולהוסיף 400 μl של בידוד מוכן על תאי Vero בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלוחיות המחוסנות ב 37 ° C עם 5% CO 2 עבור 4-6 שעות. מורחים את הבידוד על ידי הטיית הצלחת בעדינות הצידה בכל שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, להחליף את הבידוד עם תקשורת בסרום השלים (2 מיליליטר לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 שעות חיסון פוסט, לספור את מוקדי ויראלי באמצעות contr שלבמיקרוסקופ אס &#39;. חשב את כייל הנגיף כיחידות פלאק ויוצרים (PFU) לכל מ&quot;ל. ראה איור 3 עבור assay פלאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון ו להכתים את התאים ב 4% פורמאלדהיד פתרון סגול קריסטל 0.1% מוכנים באתנול 20% להדמיה ברורה של הפלאק. </li></ol> 4. Assay שכפול הגנום ויראלי Zika <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל היטב 2 כרכים מ&quot;ל באמצעות צלחת 12-היטב. למחרת, להכין inocula ויראלי (משרד הפנים של 0.01 ו -0.1; 400 μl / טוב) של כייל נמוך וגבוה באמצעות תקשורת חופשית בסרום בשלושה עותקים. עבור זיהום מדומה, השתמש תקשורת חופשית בסרום (400 μl / טוב) בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 3.2 כדי 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות זמן hr 48 ו -96, לאסוף דגימות עבור רנ&quot;א immunocytochemistry (ICC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות RNA קציר, להסיר את המדיה ולאחר מכן להוסיף 400 μl של פתרון תמוגה ישירות היטב כל לאסוף את lysates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כאל, להסיר את המדיה ואת tתרנגולת לתקן את התאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של מתנול זה היטב דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן lysate התא, לבודד RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA לפי הוראות היצרן. לכמת את RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שעתוק לאחור שני שלבים PCR כמותי (RT-qPCR) כדי לקבוע את תוכן הגנום ZIKV מ- RNA שנקטפו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיפוך לתמלל את RNA, הראשון להקים תערובת התגובה 13 μl המורכב של 5 מיקרוגרם של RNA בודד, 1 μl של dNTPs (10 מ&quot;מ), ו 1 μl hexamer אקראי (250 ng) בצינור 0.2 מ&quot;ל. דגירת הצינור ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן למקם אותו על קרח למשך דקה אחת. בהמשך לכך, להוסיף 1 μl של transcriptase הפוכה, 4 μl של חיץ סינתזה גדיל 5x, 1 μl של 0.1 M dithiothreitol, ו 1 μl של מעכב RNase לתערובת התגובה. דגירת הצינור עבור 5 דקות נוספות על 25 מעלות צלזיוס, ואחריו 60 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, inactivאכול את התגובה על ידי חימום עד 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע qPCR באמצעות 1 μl של cDNA וכתוצאה מכך עם 12.5 μl של תמהיל סופר צבע ירוק 2x המכיל DNA פולימרז ו 1 μl של פריימרים הפרט 10 מ&quot;מ ספציפיות וירוס זיקה [פריימרים גנוטיפ-פאן וירוס זיקה (עבור: 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &quot; ; Rev: 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), תחל זן PRVABC59 גנוטיפ אסיה וירוס זיקה (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; Rev: 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], או וירוס הפטיטיס C (F RTQ JFH: 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; R RTQ JFH: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;), או GAPDH גן משק הסלולר (עבור: 5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; Rev: 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;) בהיקף תגובה 25 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע PCR באמצעות התנאי בטווח 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (40 מחזורים) במערכת ה- PCR בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רמת הביטוי GAPDH מבוסס על סף מחזור (CT) ערך לנרמל את Zמדידת הגנום ika ויראלי. חישוב הדלתא CT (ΔCt) ערך של הגנום Zika בהשוואה לזו של GAPDH ולקבל את הערך 2 ΔCt. ואז, לחשב את השינוי לקפל על ידי לקיחת היחס בין תוכן הגנום מנורמל זיקה בין תאים נגועים נגועים בנקודות זמן מצוינות. ראה איור 4 עבור תוצאות שכפול הגנום ZIKV. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ICC באמצעות תאים קבוע מתנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים קבוע שלוש פעמים עם PBS 1x ולחסום עם חיץ חסימת ICC (סרום עיזים 3%, BSA 3%, 0.1% Triton-x 100 ב PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חד שבטיים העכבר J2 נוגדן אנטי dsRNA (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בשעה דילול של 1: 100 בחסימת חיץ דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם 1x PBS ולהוסיף אנטי עכבר עז משני נוגדן IgG-594 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בשעה דילול 1: 1,000 במאגר חסימת דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 1x PBS ואת הכתם עבור הגרעינים באמצעות לצבוע Hoechst ולבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלת 100X (איור 4). </li></ol></li></ol> 5. הקרנת הספרייה ציטוקין מפני הידבקות בווירוסים Zika <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל גם באמצעות צלחת 12-היטב. ברגע שהתאים מצורפים (6 שעות שלאחר זריעה), להוסיף כל ציטוקינים בריכוזים מצוינים כפילויות ביולוגיות (2 מיליליטר נפח / טוב). כלול רכב (PBS) בקר לבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12 שעות לאחר הטיפול, לבצע זיהום ויראלי זיקה (משרד הפנים של 0.1 ב 400 μl לכל היטב). כלול בארות בקרה שלילית ללא זיהום (מדומה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 4 שעות לאחר הפגיעה, להחליף את הבידוד ויראלי עם התקשורת התייחסו ציטוקינים (2 מ&quot;ל). דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 44 שעות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 לאחר הפגיעה hr, לספור רובד נגיפי באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב ולרכוש תמונות נציג של תאים נגועים ב 40X ההגדלה (איור 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report.">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li><li>Lucey, D. R., Gostin, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Zika+Pandemic:+Enhancing+Preparedness.">The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness.</a> JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).</li><li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly.">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li><li>Schuler-Faccini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Association+Between+Zika+Virus+Infection+and+Microcephaly.">Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).</li><li>Foy, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probable+non-vector-borne+transmission+of+Zika+virus,+Colorado,+USA.">Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA.</a> Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).</li><li>Kuno, G., Chang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+sequencing+and+genomic+characterization+of+Bagaza,+Kedougou,+and+Zika+viruses.">Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses.</a> Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).</li><li>Dick, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).</li><li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report,+French+Polynesia.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia.</a> Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).</li><li>Baronti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+coding+sequence+of+zika+virus+from+a+French+polynesia+outbreak+in+2013.">Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013.</a> Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+Zika+virus+in+Western+Hemisphere,+2015+[Letter].">Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter].</a> Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth.">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li><li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells.">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).</li><li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes.">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311 (2013).</li><li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome.">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li><li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy:+effects+on+fetus.">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li><li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy.">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן, פרוטוקול יעיל עבור culturing וירוס Zika במבחנה מוצג. צעדים קריטיים כולל, זיהוי נקודות קצה אופטימלית עבור בהרחבת התרבות הנגיף, מדידת כייל, וכימות שכפול הגנום נמסרו. וירוס Zika הוא פתוגן אנושי, כל כך, תוך טיפול חומרים מזהמים, נהלי בטיחות ביולוגיים הם להיות אחריו בקפדנות. שורת תאי קוף כליות, Vero, שמשה הוכחת מבחני virological שונים. קינטיקה שכפול נגיפי זיקה עשוי להיות שונה בתאים של רקמות ומינים שונים. שורות תאים נוספות ניתן להשתמש כפי שתוארו לעיל 15. וירוס Zika כבר מבודד מרקמות המוח של עוברים נגועים 3 ו הוכח להדביק ובתאים עצביים בקליפת המוח 14. לפיכך, הערכת פתופיזיולוגיה של זיהום ZIKV בתאים עצביים יכולה לספק תובנה תא ספציפי נוספות. הבדלים הפנוטיפ neurovirulent ואפריקה גנוטיפים אסיה יכול להיחקרבאמצעות מערכת התרבות זיהומיות זו. תהליך הייצור ויראלי המתואר כאן גם יהיה שימושי להפקת וירוס גבוהה כייל לשם יציאה להשתלמות in vivo פתוגניים במערכות מודל הפרימטים לא אנושיים או מכרסמים. אמנם, במחקר זה מוגבל השימוש של תאי Vero, גבוה כייל לייצר שורות תאים ממוצא אנושי יתוש יכול להיבדק. במהלך הייצור ויראלי, אם CPE הוא ציין רק 10-30% של תאים ביום 3, התאים הנגועים ניתן לפצל 1: 4 צפיפות culturing יכול להיות נמשך 4-5 ימים נוספים. בסוף היום ה -7, CPE המלא ניתן לצפות. היעילות של ZIKV הפאן-גנוטיפ פריימרים ספציפי זן הושוותה וקבעה כי הן רגישות בכימותי הגנום נגיפי Zika בתאים נגוע בנגיף כייל נמוכה וגבוהה. יתר על כן, במחקר זה, תחקיר נוגדן מבוסס מאומת לזהות תאים נגועים. dsRNA ספציפי זה נוגדן בהצלחה RECOgnized הגנום הנגיפי ציטופלסמית בתאים הנגועים בנגיף Zika. ריאגנטים מותאמים אלה יהיו משאב שימושי לנתח בשלבים שונים של שכפול נגיפי כגון תרגום, שכפול הגנום, הרכבה ומורפוגנזה virion. מערכת במבחנה זה תרבית תאי זיהומיות ישימה מחקרים עתידיים באמצעות וירוס ספציפי זיקת replicons תת-גנומי וירוס מדבק המופקת DNA משלים שיבוטים (cDNA). פיתוח שיבוטי cDNA זיהומיות ויראלי Zika יאיץ את המחקר התפקודי של גנים נגיפיים כולל ns1, ו NS4B ידי שילוב טכניקות ביולוגיות גנטיות ומולקולריות. הקמת וירוס Zika מתויג עם גן כתב מבוסס פלורסנט או הזורח תהיה כלי רב ערך בקבלה נוסף להשתמש במערכת תרבית תאי מבחני מיון גבוה תוכן. גם אני סוג וסוג II IFNs הפגינו פעילות ויראלית ואנטי-זיקה. IFN-α, IFN-β ו- IFN-γ יכולים להיות ev נוסףaluated במסגרות קליניות כמו מניעתי מניעתי, שלאחר חשיפה, וטיפול מפני הידבקות בוירוסים Zika ומחלות הקשורות. קבוצות בסיכון גבוה, כוללים בנשים הרות חיוביות עבור וירוס Zika, יכולות להיות מטופלים עם אינטרפרונים כקו ראשון לטיפול. טיפול אינטרפרון-α הוכח להיות בטוח עבור נשים בהריון 18,19. לסיכום, מערכת תרבית תאים זיהומיות, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור היבטים שונים של צמיחה ויראלי Zika מתואר ובקווי מתאר. פרוטוקול ריאגנטים המתואר כאן הם משאבים חשובים למי ללמוד וירוס Zika וקהילת המחקר הנוירולוגי.

וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן אדם חשוב הקשורות מיקרוצפליה והריון עניים ותוצאות 1,4. ZIKV שייך הסט של flaviviruses רלוונטי מבחינה רפואית שיכולה לגרום למומים נוירולוגיות כגון דנגי, קדחת הנילוס המערבי, ווירוסים אנצפליטיס בסנט לואיס. המצב העיקרי של שידור ויראלי הוא על ידי וקטור היתוש Aedes aegypti, ובנוסף, העברה מינית גם דווחה 5,6. ZIKV הפך לנושא בריאות הגלובלי גדול בשל ההתפלגות הגיאוגרפית הנרחב של וקטור יתושי הקשר החזק שלה עם מומים מולדים. ZIKV בודד לראשונה בשנת 1947 מקוף רזוס הזקיף ביער Zika, אוגנדה והתיק הראשון של האדם דווחו בשנת 1952 7,8. אנשים כי להידבק ZIKV הנוכחי עם סימפטומים קלים כגון חום, פריחה, כאבי ראש, דלקת הלחמית, ושרירים / כאבי פרקים. אינפקטד נשים בהריון יכולים לשדר ZIKV לעובר המתפתח 1. Zזיהום IKV גם נקשר תסמונת גיאן-בארה, demyelination אוטואימוניות עצבים היקפיים הפרעת 9. הגנום הויראלי Zika מורכב במובן החיובי, מולקולת רנ&quot;א חד-גדילי שזה בערך 10.8 kilobases באורך. מבנה הגנום מאורגן כמו 5&#39;NCR-C-PRM-E-ns1-NS2A-NS2B-ns3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3&#39;NCR, עם אזורים קידוד אי (NCR) איגוף אזור המקודדים חלבונים 6. Polyprotein יחיד (3419 אא) מתורגם כי הוא שיתוף ופוסט translationally ביקע ל -10 פפטידים קטנים. הן 5&#39;NCR ומבני לולאת גזע 3&#39;NCR RNA לשחק תפקיד קריטי תחילתו של תרגום הגנום נגיפי ושכפול. הרכיבים המבניים של הגנום מורכבים של קפסיד, קרום, וחלבוני מעטפה. החלבונים הלא המבניים הם קריטיים עבור שכפול הגנום. נכון לעכשיו, זני הנגיפים Zika מקובצים לשלוש גנוטיפים עיקריים: אפריקה המערביתבמזרח, אפריקה, ואסיה 6,10-13. הוצע כי שושלת מזרח אפריקה התפשטה במערב אפריקה ואסיה, שם הוא מאוחר יותר התפתח 12. הגנוטיפ אסיה אחראי ההתפרצויות הנוכחיות ביבשת אמריקה. וירוס הזיקה יכול להיות מתורבת בשני יתושים בתאי יונקים. פיברובלסטים עורי ראשיים, תאים דנדריטים בשלים, ובתאים עצביים בקליפת המוח, ותאי Vero חשופים לסכנת הדבקה ויראלית Zika 10,14,15. סוג I וסוג שני II אינטרפרונים הוכחו להגביל את שיעור הגידול ZIKV ב fibroblasts העור 15. המטרות של מחקר זה הן לספק פרוטוקול צעד חכם, מפורט לייצור assaying של PRVABC59 זן ויראלי Zika גנוטיפ אסיאתית מערכת תרבית תאים יונקת וכדי להדגים את התועלת של מערכת התרבות זיהומיות זו כפלטפורמה לפיתוח תרופות. משאב זה הוא בעל פוטנציאל תועלת רב קהילת המחקר ויראלי ונוירולוגיות Zika להבהיר עוד iמנגנוני ts של בפתוגנזה ואבולוציה ויראלי של ארסיות ויראלי.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Countess &amp;ndash; Automated Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess-cell counting&amp;nbsp; chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&amp;nbsp;</td><td>English &amp;amp; Scientific Consulting Kft.</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cell Line&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>Zika viral strain PRVABC59</td><td>Centers for Disease Control and Prevention (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 alpha&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interferon alpha A&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>Interferon beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI</td><td>Nikon</td><td>Visit Nikon for Request</td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus infectious cell culture system and the in vitro prophylactic effect of interferons

וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן מתעוררים מקושר ליקויים התפתחותיים בעובר כגון מיקרוצפליה, פגמי עין, וצמיחה לקויה. ZIKV הוא וירוס RNA של המשפחה Flaviviridae. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושים, אבל יכול גם להיות מופץ על ידי אימהי העברה אנכית עוברת וכן מגע מיני. נכון להיום, לא קיימות אופציות טיפול או חיסון אמין זמינות להגן על אלה שהנגיף יחדור. פיתוח מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס לשחזור, יעיל Zika הוא קריטי לחקר המנגנונים המולקולריים של שכפול ZIKV וכן פיתוח תרופות חיסון. בהקשר זה, פרוטוקול המתאר מערכת התרבות יונקים מבוססי תאים במבחנה Zika וירוס לניתוח בייצור ובצמיחה ויראלי מדווח כאן. פרטים על היווצרות הפלאק על ידי וירוס Zika על monolayer תא ורובד assay למדידת כייל הנגיף מוצגים. קינטיקה שכפול הגנום ויראליביניים replicatory הגנום RNA פעמיים תקועים נחושים. פלטפורמה תרבות זו נוצלה למסך נגד ספריה של קבוצה קטנה של ציטוקינים וכתוצאה מכך לזיהוי-α אינטרפרון (IFN-α), IFN-β ו- IFN-γ כמו מעכבים חזקים של גדילת ויראלי Zika. לסיכום, במבחנת מערכת תרבות ויראלית מדבקת Zika מבחני virological שונים הם הפגינו במחקר זה, אשר יש לו את הפוטנציאל למען קהילת המחקר מאוד הבהרה נוספת המנגנונים בפתוגנזה ויראלי ואת האבולוציה של ארסיות ויראלי. אנטי IFN-alpha ניתן להעריך עוד יותר כאמצעי מניעה מניעתי, שלאחר החשיפה, אפשרות טיפול עבור נגיף Zika באוכלוסיות בסיכון גבוה, כולל בנשים הרות שנדבקו במחלה.

זן ויראלי זיקה (PRVABC59; KU501215 מספר ההצטרפות GenBank) של גנוטיפ אסיה נוצל במחקר זה 12. תאים Vero ב 80% confluency שימשו חוקרת דה נובו זיהום ויראלי Zika. לייצור ויראלי ואפיון Virological עוקב אחד פרקים מוקדמים (P3) וירוס Zika הועסק. הפלאק ויראלי נצפה ביום השני של זיהום. Progenies ויראלי Zika שוחרר מהתא נגוע בתחילה יכול להתפשט תאים שכנים, אשר לגרום להיווצרות פלאק גלוי על תרבות בשכבה (איור 2). השפעת cytopathic (CPE) של זיהום ויראלי Zika מאופיין שינויים מורפולוגיים כגון עיגול וניתוק של תאים, כמו גם מוות תאי ממס. למדידת כייל הנגיף, supernatant ללא התא המכיל וירוס שנקטפו מן צלוחיות T-160 היה נתון של 10 folדילול סדרתי ד והוסיף על monolayer של תאים Vero במתכונת צלחת 12-היטב (איור 3). נקודת הזמן 48 שעות לאחר חיסון שימש נקודת הסיום כדי להימנע מספירת הפלאק הנובעים זיהום משני. הבארות עם 30-100 הפלאק נבחרו לספירה להשיג כייל מדויק. assay RT-qPCR נוצל כדי להעריך את שכפול הגנום של הנגיף Zika. זוג פריימר הפאן-גנוטיפ ספציפי לאזור השמור ביותר ZIKV NS5 נכלל 3,16. פריימרים PRVABC59 ספציפי זן ויראלי Zika המבוסס על מיקומו הגנומי של פריימרים הפאן-גנוטיפ (רצפים של פריימרים ניתנים באזור פרוטוקול 4.4.2) נבדקו גם. שני זוגות פריימר הראו רמות דומות של רגישות הגברת הגנום נגיפי זיקה בין תאים נגועים (איור 4). כביקורת שלילית, פריימרים וירוס ספציפי הפטיטיס C נבחנו גם 17. אינקר משמעותילהקל בתוכן הגנום הנגיפי ZIKV נצפתה בין 48 ו -96 נקודות hr זמן הן התאים נמוך וגבוה משרד הפנים נגוע, דבר המצביע על זיהום ויראלי חזקים (איור 4). במהלך שכפול הגנום Flavivirus, פעמים תקועות (ds) RNA ביניים replicatory נוצרים כתוצאה מהיווצרותם של זיווג בסיס בין תחושה ו- RNA הגנומי אנטי תחושה. תחקיר נוגדן במיוחד עבור dsRNA הכרה זוהה תאים נגועים ויראלי (איור 4). dsRNA הנגיפי היו נקודות אל הציטופלסמה דבר המצביע על תאי שכפול הגנום. מכתים Immunocytochemistry גילה הרחבת תאים נגועים בנגיף במהלך 48 ו -96 נקודות hr הזמן. באמצעות מערכת התרבות הנגיף מדבק Zika, ספרייה קטנה של ציטוקינים הוקרן לקבוע פעילות אנטי (איור 5). התאים היו טרום שטופלו ציטוקינים שונים במשך 12 שעות ולאחר מכן נגוע בווירוס Zika. אני הייתי סוג<html> nterferon, IFN-α, הציג פעילות אנטי חזק נגד וירוס Zika במגוון רחב של המינונים שנבדקו [10 יחידות בינלאומיות (IU), 100 IU ו -1,000 IU]. IFN-β הפגין השפעה מעכבת חזקה גם כן. השנייה IFN-γ סוג הדגים גם פעילות ויראלית ואנטי-זיקה. ציטוקינים-α TNF, IL-1 ו- IL-6 לא לעכב ZIKV על ריכוזי התרופה המצוין. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig1.jpg" /> איור 1:. מתווה כללי של ייצור וירוס Zika ועל העבודה assay עבור ייצור וירוס, ZIKV הוא מחוסן על תאים Vero צלוחיות בתרבית רקמה T-160. בשעה 48 או 96 HPI, supernatant וירוס תא ללא נאסף המאוחסן ב -80 ° C לניתוח במורד הזרם. כייל הנגיף נמדדת על ידי assay דילול מגביל. בידוד וירוס Zika הוא לאחר מכן נעשה שימוש ללימוד קינטיקה שכפול נגיף וסינון תרכובות תרופה.יעד href = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig3.jpg" /> איור 3:. Assay פלאק למדידת הייצור וירוס Zika תאים Vero נאיבי שימשו למדידת כייל הנגיף. תמונות שדה מוארות לתאר את הצפיפות של רובד נגיפי ב דילולים שונים (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). הערה: 1:. תמונת הדילול 100 תערוכות הפלאק ברורה כי ניתן לספור במדויק <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig4.jpg" /> איור 4: מבחנים להערכת שכפול נגיף Zika. </strong&gt; (א) גרף המציג תוכן גנומי וירוס זיקה שהיא נמדדת על ידי RT-qPCR. שני-גנוטיפ פאן (ZIKV GEN) ו-זן PRVABC59 (ZIKV UNI) פריימרים הראה רגישות וסגוליות שווה. כצפוי, הפטיטיס C ויראלי (HCV) פריימרים לא להגביר כל מוצר. (ב) גרף המציג את קינטיקה צמיחת ויראלי Zika בנקודות הזמן שצוינו תאים נגועים כיילו נמוכים וגבוהים בהשוואה לזו של השליטה מדומה הנגועה. ערכים ממוצעים וסטיות תקן מקבלים. (C) assay Immunocytochemistry לחקירת שכפול נגיפי. תאים נגועים בנגיף Zika הוכתמו במיוחד עם נוגדן dsRNA. בשעה 48 HPI, תאים נגועים נמצאים כמה אשכולות, ואילו ב 96 HPI רוב התאים נדבקים. Hoechst כתם שימש הדמיה של גרעינים (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). BF:. תמונת שדה מוארת <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו</a>. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig5.jpg" /> איור 5:. אינטרפרונים להפגין פעילות ויראלית ואנטי-זיקה חזקה (א) גרף המציג אפנון של צמיחה ויראלי Zika ידי ציטוקינים שונים בהשוואה לזו של שליטה ברכב. ערכים ממוצעים וסטיית תקן מוצגים בגרף הבר. אינטרפרונים הראה עיכוב משמעותי סטטיסטי של שכפול נגיף זיקה (ערך p &lt;0.05). (B ו- C) בניגוד שלב תמונות של תאים נגועים בנגיף זיקה עם או ללא טיפול ציטוקינים. הפלאק ויראלי נוצר על ידי תאים נגועים ניתן לראות מוקדים. שים לב בארות שטופלו באינטרפרון אין רובד נגיפי. שליטה מדומה ללא זיהום ZIKV כלל שליטה שלילית. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54767/54767fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול</a>גרסה של נתון זה.

Watch this Scientific Journal Video about Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons at JoVE.com

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

20.7K Views.  Cedars-Sinai Medical Center. Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Video: Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Developmental Biology

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

דגמי Zika בנגיף של ה בפיתוח המוח האנושי במבחנה באמצעות תאי גזע נגזר Organoids מוחי

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Neuroscience

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral load. The purpose of the procedure is to quantify viral titers in peripheral and CNS areas of the mouse at different time points post infection or under different experimental conditions to identify virologic and immunological factors that regulate Zika virus infection. The organ isolation procedures demonstrated allow for both focus forming assay quantification and quantitative PCR assessment of viral titers. The rapid organ isolation techniques are designed for the preservation of virus titer. Viral titer quantification by focus forming assay allows for the rapid throughput assessment of Zika virus. The benefit of the focus forming assay is the assessment of infectious virus, the limitation of this assay is the potential for organ toxicity reducing the limit of detection. Viral titer assessment is combined with quantitative PCR, and using a recombinant RNA copy control viral genome copy number within the organ is assessed with low limit of detection. Overall these techniques provide an accurate rapid high throughput method for the analysis of Zika viral titers in the periphery and CNS of Zika virus infected animals and can be applied to the assessment of viral titers in the organs of animals infected with most pathogens, including Dengue virus.

The goal of the protocol is to demonstrate the techniques used to investigate viral disease by isolating and quantifying Zika virus, from multiple organs in a mouse following infection.

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture plate wells embedded with electrodes. The technology can be used to monitor the consequences of Zika virus (ZIKV) infection and adherent cell replication in real time, as this virus is highly cytopathogenic. It is a straightforward assay that does not require the use of labels or invasive methods and has the benefit of providing real-time data. The kinetics of ZIKV infection are highly dependent on the employed cell line, virus strain, and multiplicity of infection (MOI), which cannot be easily studied with conventional endpoint assays. Furthermore, the CEI assay can also be used for the evaluation and characterization of antiviral compounds, which can also have dynamic inhibitory properties over the course of infection. This methods article gives a detailed explanation of the practical execution of the CEI assay and its potential applications in ZIKV research and antiviral research in general.

Here, we demonstrate the use of cell-based electrical impedance (CEI) as a very easy and straightforward method to study Zika virus infection and replication in human cells in real time. Furthermore, the CEI assay is useful for the evaluation of antiviral compounds.

פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

Source: Contreras, D. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54767">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

בדיקת מבחנה לבדיקת אינטרפרונים כמעכבים חזקים של צמיחת נגיף זיקה

1. Screening Cytokine Library against Zika Virus Infection

	Seed naive Vero cells at 1 x 105 cells per well using a 12-well plate. Once the cells are ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunotherapy

Immunogenics and Vaccine Development

Zika Virus Infection of Fetal Neural Stem Cells

Source: McGrath, E. L., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56917">Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a procedure to infect human fetal neural stem cells with Zika virus. The infected cells can be used for further studies.

Source: McGrath, E. L., et al., Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis. J. Vis. Exp. (2018)
...

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video