Name: a method for measuring rna n6-methyladenosine modifications in cells and tissues
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues at JoVE.com

C.Y.W. received support from the National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), the National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009), and Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091, and CMRPG3C1763).

הערה: רנ&quot;א הכל מ 6 רמה כוללת rRNA, mRNA, ו RNA קטנים אחרים. מאז RNA ריבוזומלי יש מ שופע 6 שינויים A, מדידת מ 6 הבגרויות תצטרך לשקול את העובדה הזו. בידוד RNA 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרון טיהור ribonuclease (מרוסס על מגבות נייר), לנגב את טפטפות ומשטחי ספסל מעבדה. מגבות נייר רטובות עם מי nuclease ללא ולנגב טפטפות ומשטחי ספסל במעבדה שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד RNA סה&quot;כ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בוחש עילי, homogenize 50-100 מ&quot;ג של רקמה או 5-10 x 10 6 תאים 1 מ&quot;ל של תמיסת בידוד RNA שמרו על 4 מעלות צלזיוס. הערה: רקמה יותר (100-150 מ&quot;ג) עשויה להידרש דגימות רקמה שומניות מעכברים בגלל ריכוזי RNA הנמוכים בו. דוגמאות שמקורו מן הלב העכבר, כבד, שרירי השלד, ריאות, מוח, מקרופאגים הועסק 4 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בcubate homogenates מדגם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של 1-bromo-3-chloropropane (BCP) לכל 1 מ&quot;ל של homogenate המדגם. לנער את צינורות בתוקף למשך 15 שניות ולהמשיך לבודד רנ&quot;א הכל על פי הוראות היצרן 24. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Polyadenylated mRNA טיהור מ- RNA סה&quot;כ מבודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר mRNA polyadenylated באמצעות ערכות או פרוטוקולים זמינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער היטב מחדש להשעות כל אחד מהפתרונות הבאים: פתרון מחייב 2x, אוליגו חרוזי פוליסטירן (DT), והפתרון לשטוף. ודא אוליגו (DT) חרוזים חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 120 μL של פתרון elution לכל הכנה לתוך צינור וחום עד 70 ° C בתוך גוש חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עד 500 מיקרוגרם של רנ&quot;א הכל לתוך צינור microcentrifuge. עם nuclease ללא מים, להתאים את עוצמת הקול כדי 250 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL של פתרון מחייב 2x אל רנ&quot;א הכל כךlution מערבולת בקצרה לערבב את תוכנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו 15 μL של אוליגו (DT) חרוז מערבולת ביסודיות לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם מגוש החימום ולתת לו לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant, משאיר מאחוריו כ 50 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של פתרון לשטוף מחדש להשעות את הגלולה ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה לתוך מערכת צינור ספין מסנן / אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. הסר את עמודת צינור איסוף וזורק את הזרימה דרך. החזר את עמודת צינור האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 500 μL של פתרון לשטוף על מסנן הספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את מסנן הספין לתוך צינור איסוף טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μL של פתרון elution מחומםעד 70 ° C על גבי במרכז מסנן הספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2-5 דק &#39;ב 70 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נוסף 50 μL של פתרון elution מחומם ל -70 מעלות צלזיוס על גבי במרכז מסנן הספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גליקוגן, 0.1 נפח של 3 M חיץ נתרן אצטט (5.2 pH), ו 2.5 כרכים של אתנול אבסולוטי. משקע הלילה ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 25 דקות ב 4 °. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ&quot;ל של אתנול 75%. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש באוויר במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של מי nuclease ללא לפזר את הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -70 ° C. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכשרת RNA וכימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ספקטרופוטומטר, לקבוע את ריכוז RNA על ידי NotIng את הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר. יחס 260/280 צריך להיות 1.8-2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות המדגם RNA באמצעות 0.8% ג&#39;ל agarose אלקטרופורזה 25. הערה: רנ&quot;א הכל ללא פגע איקריוטיים צריך להראות 28S אינטנסיבי 18S rRNA להקות. יחס 28S לעומת עוצמת להקת 18S rRNA עבור הכנת RNA טובה הוא ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. ג&#39;ל אלקטרופורזה והסעה הערה: הפרוטוקולים כן חיץ ניתנים בטבלת 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ג&#39;ל פורמלדהיד (1%) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כל הציוד אלקטרופורזה עם diethylpyrocarbonate (DEPC) מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2.5 גרם של agarose ב 215 מ&quot;ל מים DEPC לחלוטין במיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12.5 מ&quot;ל של 10x 3- (N- morpholino) חומצה propanesulfonic (מגבים) חיץ 22.5 מ&quot;ל של פורמלדהיד 37%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתבנית המנגנון אלקטרופורזה עם מסרק סמיך 1.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל בועות או לדחוף tשולי עד הקצוות הג&#39;ל במסרק נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הג&#39;ל לחזק בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1-10 מיקרוגרם של RNA סך 11.3 μL של חיץ מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 מיקרוגרם של הסמן RNA (1 מיקרוגרם / μL) עם 11.3 μL של חיץ מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים nuclease ללא דגימות 2.2.1 ו 2.2.2 כדי בהיקף כולל של 16 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן לצנן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 16 μL של המדגם מ 2.2.3 עם 4 μL של צבע מעקב, המכיל 0.1 מיקרוגרם / μL ethidium ברומיד על הקרח. זהירות: ברומיד Ethidium הוא אולי טרטוגניות ורעילים אם נשאף. קרא גליון בטיחות ברומיד ethidium. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרופורזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מ&quot;ל של 10x מגבים חיץ ל -1,800 מ&quot;ל של DDH 2 O לבצע למאגר פועל מגבים 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש למאגר פועל מגבי 1x לשטוף את הבארות של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> t טרום ריצההוא הג&#39;ל על 20 V למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את דגימות רנ&quot;א לתוך הבארות של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור. הפעלה ב 35 V עבור כ -17 שעות (לילה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ולצלם את הג&#39;ל תחת אור UV. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַעֲבִיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את ג&#39;ל להסרת החלק בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל של 10x חיץ SSC (250 מ&quot;ל של חיץ 20x SSC ו 250 מ&quot;ל מים DEPC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל פעמיים עם חיץ 10x SSC במשך 20 דקות עם רועד ב 50 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי 1 נייר סינון גיליון גדול מספיק כדי לשמש נייר פתילה, אשר סופג חיץ העברה ממגש ההעברה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 4 חתיכות של נייר סינון לאותו גודל כמו ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 1 גיליון קרום ניילון חיובי טעונים לאותו גודל כמו ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן חריץ על הג&#39;ל ואת הקרום כסמן כדי להבטיח את הכיוון הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הממברנה חיץ 2x SSC במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 500 מ&quot;ל of 10x SSC חיץ למגש ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את גיליון נייר סינון גדול על פני הצלחת זכוכית להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרדד כל בועות עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרי 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך חיץ העברה ומניח אותם על המרכז של נייר הסינון משלב 2.4.5. הסר את כל בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדף בצד ג&#39;ל למטה על נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרום על גבי הג&#39;ל. ישר את החריצים של הג&#39;ל ואת הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך על גבי הממברנה ואת להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל בועות בין השכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בניילון סביב הג&#39;ל על מנת להבטיח כי רק מגבה לספוג חיץ עובר דרך ג&#39;ל הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטאק את מגבות נייר על גבי נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צלחת זכוכית גדולה על גבי המגבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים משקל על החלק העליון של הערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">שמור לילה לאפשר RNA להעביר מן הג&#39;ל על הממברנה. </li></ol></li></ol> 3. איתור של N 6 -methyladenosine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממברנה Crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קרום לחת חיץ 2x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 גיליונות נייר מסנן שקוע עם 10x חיץ SSC לתוך crosslinker UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום על גבי נייר הסינון, כשהצד RNA-adsorbed פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מצב autocrosslink&quot; (120,000 μJ) ולחץ על כפתור &quot;התחל&quot; כדי להתחיל את ההקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הממברנה ואת ג&#39;ל עם לוכד תמונה ג&#39;ל UV כדי לאשר את העברת RNA מן הג&#39;ל על הממברנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה ב 5% חלב דל שומן מלוחים טריס שנאגרו עם 20 Tween (TBST) חיץ בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה לילה מ 6 (&lt;em&gt; N 6 פתרון נוגדנים -methyladenosine) (1: 1,000 ב 5% דל שומן חיץ חלב TBST) ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה ב HRP-מצומדות חמור פתרון נוגדנים נגד ארנב (1: חיץ 2,000 5% דל שומן חלב TBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את המצע chemiluminescent משופרת (0.125 מ&quot;ל לס&quot;מ 2 של קרום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את chemiluminescence עם ההגדרות האופטימליות של תרמי הדיגיטלי, על פי הוראות יצרן 26. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ 6 כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את עוצמת chemiluminescent היחסית מ 6 באמצעות תוכנת ImageJ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט התוכנה ImageJ, בחר באפשרות &quot;קובץ&quot; כדי לפתוח את הקובץ הרלוונטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;מלבן&quot; מ ImageJ ולצייר על ידי מסגרת סביבאת האותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם RNA ריבוזומלי הוא לא המוקד של ניסויים, להימנע להקות ריבוזומלי 18S ו -28 RNA מ 6 לחישוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;פיקוד&quot; ו &quot;1&quot; כדי לאשר את השביל שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;פיקוד&quot; ו &quot;3&quot; כדי להראות את העלילה שנבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכלי &quot;ישר&quot; לצייר קווים כדי להפריד את האזור המפולח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכלי &quot;שרביט&quot; כדי לרשום את המידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את רמות א מ 6 עם להקת RNA ריבוזומלי 18S מן המכתים ברומיד ethidium. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thammana, P., Held, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+16S+RNA+during+ribosome+assembly+in+vitro.">Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro.</a> Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).</li><li>Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+epitranscriptome:+N6-methyladenosine+and+gene+expression+control.">The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyl-adenosine+(m6A)+in+RNA:+an+old+modification+with+a+novel+epigenetic+function.">N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).</li><li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+FTO+in+adipose+tissue+decreases+Angptl4+translation+and+alters+triglyceride+metabolism.">Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism.</a> Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-adenosine+methylation+in+MiRNAs.">N6-adenosine methylation in MiRNAs.</a> PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).</li><li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+N6-methyladenosine+in+bacterial+mRNA.">Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+N-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA.">The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. , (2016).</li><li>Fustin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-methylation-dependent+RNA+processing+controls+the+speed+of+the+circadian+clock.">RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock.</a> Cell. 155 (4), 793-806 (2013).</li><li>Geula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells.+m6A+mRNA+methylation+facilitates+resolution+of+naive+pluripotency+toward+differentiation.">Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).</li><li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy.">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. , (2016).</li><li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+in+nuclear+RNA+is+a+major+substrate+of+the+obesity-associated+FTO.">N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO.</a> Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).</li><li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+study+of+the+m6A+genes+with+major+depressive+disorder+in+Chinese+Han+population.">An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population.</a> J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).</li><li>Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+RNA+N6-methyladenosine+and+the+role+of+cryptochrome.">Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).</li><li>Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+modulates+circadian+rhythms+and+inhibits+the+CLOCK-BMAL1-induced+transcription.">FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription.</a> Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).</li><li>Heyn, H., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adenine+Code+for+DNA:+A+Second+Life+for+N6-Methyladenine.">An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine.</a> Cell. 161 (4), 710-713 (2015).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+m(6)A+Reader+YTHDC1+Regulates+mRNA+Splicing.">Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing.</a> Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3'+UTRs+and+near+stop+codons.">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li><li>Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+N6-methyladenosine+residues+in+bovine+prolactin+mRNA.">Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).</li><li>Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+N6-methyladenosine+in+expression+of+Rous+sarcoma+virus+RNA:+analyses+utilizing+immunoglobulin+specific+for+N6-methyladenosine.">Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine.</a> Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).</li><li>Golovina, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+site-specific+detection+of+m6A+nucleoside+presence+in+RNA+based+on+high-resolution+melting+(HRM)+analysis.">Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome.">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+Methylated+Cytidine+and+Adenosine+in+Cellular+and+Tissue+RNA+by+Nano-Flow+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+the+Stable+Isotope-Dilution+Method.">Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method.</a> Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA.">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).</li><li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy.">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. 6, 18874 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N-methyladenosine+methylome.">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome.</a> Nat Chem Biol. , (2016).</li><li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+16S+ribosomal+RNA+gene+amplicons.">Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li><li>Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+ribosomal+RNA+for+mosquito+gut+metagenomic+RNA-seq.">Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-Northern+Blotting:+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides.">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).</li><li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+RNA+modifications+in+disease.">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded8. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications27.
It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.
Transcriptome-wide mapping with m6A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA22. It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m6A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult18. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m6A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing30. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene's information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups. 
Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control31. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.
The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.
As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name "northeastern" blotting for the current technique.

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N6-methyladenosine (m6A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes1. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA2. The m6A modifications of mRNA influence their splicing3, translation4, degradation5, and localization2. Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function6. The evolutionary conservation of m6A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans7. Delineation of the roles of m6A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA8 also play critical roles in RNA metabolism. 
Circadian rhythms9, stem cell pluripotency10, triglyceride metabolism4, fibrosis11, obesity12, and major depression13 are a few examples of processes where m6A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m6A sites14. Modulation of m6A methylase or demethylase elicits circadian period changes15. Mettl3, an m6A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage10. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m6A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl44. These studies reveal that m6A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m6A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.
Several methods are available to measure m6A modifications of RNA16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m6A in several RNAs19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m6A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry21. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m6A-Seq)22 immunoprecipitates fragmented RNAs with m6A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m6A landscapes. High-resolution mapping of m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m6A modifications at a single-nucleotide resolution23. Both methods provide details of m6A modification across the whole transcriptome, with specific genes' information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m6A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m6A levels. To detect global m6A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis18. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m6A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

<table><tbody><tr><td>RNaseZap solution</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>Protocol 1.1</td></tr><tr><td>TRI Reagent solution</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td><td>Protocol 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-chloropropane (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Protocol 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>Protocol 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Protocol 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>Protocol 1.2.2.1</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>Protocol 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>Protocol 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>Protocol 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Protocol 2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td><td>A426</td><td>Protocol 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Protocol 2.1.3</td></tr><tr><td>37% formaldehyde Solution</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Protocol 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, Disodium Salt</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer</td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Protocol 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA Millennium Marker</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>Protocol 2.2.2</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Protocol 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>Protocol 2.2.5 tracking dye</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>Protocol 2.2.5 tracking dye</td></tr><tr><td>Xylene Cyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Protocol 2.2.5 tracking dye</td></tr><tr><td>Sodium chloride dihydrate</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Protocol 2.4.2 20x SSC buffer</td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Protocol 2.4.2 20x SSC buffer</td></tr><tr><td>Hybond Blotting Paper</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN6101M</td><td>Protocol 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N+ membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td>Protocol 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>Protocol 3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>ANT Technology</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protocol 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;A (N&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;-methyladenosine)</td><td>Synaptic Systems</td><td>202003</td><td>Protocol 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protocol 3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>Protocol 3.2.8</td></tr></tbody></table>

a method for measuring rna n6-methyladenosine modifications in cells and tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

לאחר 14 ימים בשלב יממה רגיל-כהה אור, עכברי wild-type הונחו בחשכה מתמדת. RNAs מהכבד נדגמו ב 4 במרווחים hr ולמד עם סופג הצפוני שונה. מתילציה של rRNAs, mRNAs, ו RNA הקטן התגלתה בבירור (איור 2). ההשוואה בין זמני יממה שונים (CT) ניתן לחשב במדויק עם תקן 18S rRNA. הייתה תנודת יממה חזקה של רמות מ 6 ב rRNA, mRNA, ו RNA הקטן. כדי למנוע את ההפרעה שהוצעה על ידי rRNA, RNAs polyadenylated יכול להיות מטוהר, כמו בשלב 1.2.2. לאחר הטיהור, rRNA ניתן למנוע במידה רבה, כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של RNAs האחר (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; איור 1: רכבת יחידת העברת כתם. יחידת העברת נימים עבור סופג את הרנ&quot;א על ​​הקרום מוצגת. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> איור 2: קצב היממה של בחינות הבגרות מ 6 ב C57BL / 6J. נתון זה מראה את מ 6 כתם של RNA הכולל כבדים עכברי-בר הקריב ביום הראשון של השלב הכהה כהה לאחר 14 ימים של שלב אור כהה רגיל ב 4 במרווחי h. כימות נעשה באמצעות מ 6 הפרש צפיפות התמונה בין 18S ו -28 rRNA. מ &#39;6 שפע היה מנורמל הלהקה 18S rRNA מן הג&#39;ל פורמלדהיד בתחתית.et = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> איור 3: כתמי הקלע זרק 6 עם או בלי rRNA. כתמי נציג מ 6 א &#39;של רנ&quot;א הכל ו- RNA polyadenylated מן הכבדים של עכברי-בר מוצגים. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> חיץ 10x מגבים (pH 7.0, להגן מפני אור) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מגבים </td><td> 41.85 </td><td> g </td><td> 0.2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> אצטט נתרן </td><td> 4.1 </td><td> g </td><td>0.05 מ &#39; </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, Disodium מלח </td><td> 3.7 </td><td> g </td><td> 0.01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מי DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> סה&quot;כ </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מערבבים בטמפרטורת החדר </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20x חיץ SSC (pH 7.0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> נתרן כלורי </td><td> 175.3 </td><td> g </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> ציטראט Trisodium </td><td> 88.3 </td><td> g </td><td> 0.3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מי DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> סה&quot;כ </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> מערבבים בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> דיי מעקב </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> חיץ 10x מגבים </td><td> 500 </td><td> μL </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0.75 </td><td> g </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> bromophenol כחול </td><td> 0.01 </td><td> g </td><td> 0.2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> קסילן Cyanol </td><td> 0.01 </td><td> g </td><td> 0.2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מי DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> סה&quot;כ </td><td> 5 </td><td> מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> חנות ב -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> מי DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> לדלל יחס של 1: 1,000 של DEPC DDH 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> מערבבים למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> חיץ מדגם (להגן מפני אור) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> חיץ 10x מגבים </td><td> 200 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% פורמלדהיד </td><td> 270 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Formamide </td><td> 660 </td><td> μL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> חנות ב -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> טבלה 1: חוצצים ופתרונות.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues at JoVE.com

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N 6 -methyladenosine (מ 6 א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

10.9K Views.  Chang Gung Memorial Hospital, Chang Gung University College of Medicine.  שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N 6 -methyladenosine (מ 6 א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים. 

Video: A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Genetics

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and sequencing (MeRIP-seq) is a method that aims to enrich for methylated RNA and ultimately identify modified transcripts. Briefly, sonicated RNA is incubated with an antibody for 5-methylated cytosines and precipitated with the assistance of protein G beads. The enriched fragments are then sequenced and the potential methylation sites are mapped based on the distribution of the reads and peak detection. MeRIP can be applied to any organism, as it does not require any prior sequence or modifying enzyme knowledge. In addition, besides fragmentation, RNA is not subjected to any other chemical or temperature treatment. However, MeRIP-seq does not provide single-nucleotide prediction of the methylation site as other methods do, although the methylated area can be narrowed down to a few nucleotides. The use of different modification-specific antibodies allows MeRIP to be adjusted for the different base modifications present on RNA, expanding the possible applications of this method.

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

The methylated RNA immunoprecipitation assay is an antibody-based method used to enrich for methylated RNA fragments. Coupled with deep sequencing, it leads to the identification of transcripts carrying the m5C modification.

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a complementary DNA (cDNA) intermediate. However, such approaches are rarely applied as a de novo RNA sequencing method, but used mainly as a tool that can assist in quality assurance for confirming known sequences of purified single-stranded RNA samples. Recently, we developed&#160;a direct RNA sequencing method by integrating a 2-dimensional mass-retention time hydrophobic end-labeling strategy into MS-based sequencing (2D-HELS MS Seq). This method is capable of accurately sequencing single RNA sequences as well as mixtures containing up to 12 distinct RNA sequences. In addition to the four canonical ribonucleotides (A, C, G, and U), the method has the capacity to sequence RNA oligonucleotides containing modified nucleotides. This is possible because the modified nucleobase either has an intrinsically unique mass that can help in its identification and its location in the RNA sequence, or can be converted into a product with a unique mass. In this study, we have used RNA, incorporating two representative modified nucleotides&#160;(pseudouridine (&#936;) and 5-methylcytosine (m5C)), to illustrate the application of the method for the de novo sequencing of a single RNA oligonucleotide&#160;as well as a mixture of RNA oligonucleotides, each with a different sequence and/or modified nucleotides. The procedures and protocols described here to sequence these model RNAs will be applicable to other short RNA samples (&#60;35 nt) when using a standard high-resolution LC-MS system, and can also be used for&#160;sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides.&#160;In the future, with the development of more robust algorithms and with better instruments, this method could allow sequencing of more complex biological samples.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

Here, we describe a detailed protocol for an LC-MS-based sequencing method that can be used as a direct method to sequence short RNA (&#60;35 nt per run) without a cDNA intermediate, and as a general method to sequence different nucleotide modifications in a single study at single-base precision.

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction with other molecules, including other proteins or nucleic acids. This work presents an easily implementable protocol for quantifying arginine and its derivatives, including asymmetric and symmetric dimethylarginine (ADMA and SDMA, respectively) and monomethyl arginine (MMA). Following protein isolation from biological body fluids, tissues, or cell lysates, a simple method for homogenization, precipitation of proteins, and protein hydrolysis is described. Since the hydrolysates contain many other components, such as other amino acids, lipids, and nucleic acids, a purification step using solid-phase extraction (SPE) is essential. SPE can either be performed manually using centrifuges or a pipetting robot. The sensitivity for ADMA using the current protocol is about 100 nmol/L. The upper limit of detection for arginine is 3 mmol/L due to SPE saturation. In summary, this protocol describes a robust method, which spans from biological sample preparation to NMR-based detection, providing valuable hints and pitfalls for successful work when studying the arginine methylome.

The present protocol describes the preparation and quantitative measurement of free and protein-bound arginine and methyl-arginines by 1H-NMR spectroscopy.

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Cancer Research

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which are involved in many cell activities. Here, we describe a rapid and reliable method for the absolute qualification of nucleoside/nucleotide contents in plants. Briefly, 100 mg of homogenized plant material was extracted with 1 mL of extraction buffer (methanol, acetonitrile, and water at a ratio of 2:2:1). Later, the sample was concentrated five times in a freeze dryer and then injected into an HPLC-MS/MS. Nucleotides were separated on a porous graphitic carbon (PGC) column and nucleosides were separated on a C18 column. The mass transitions of each nucleoside and nucleotide were monitored by mass spectrometry. The contents of the nucleosides and nucleotides were quantified against their external standards (ESTDs). Using this method, therefore, researchers can easily quantify nucleosides/nucleotides in different plants.

A precise and reproducible method for in vivo nucleosides/nucleotides quantification in plants is described here. This method employs an HPLC-MS/MS.

הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Developmental Biology

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

אפיון שינויי RNA בתאי עצב בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

שיטה למדידת RNA

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m⁵C שינוי ערבידופסיס

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

אפיון שינויי RNA בתאי עצב בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה