אנו מודים סוף Gournet לעזרה עם איורים, גולות Chaumeil לקריאת כתב היד, מתקן דיור חיה ואת פלטפורמת ההדמיה של היחידה. עבודה זו קיבלה תמיכה במסגרת תוכנית «Investissements d&#39;Avenir» שהושק על ידי ממשלת צרפת ויושמו על ידי ANR עם אזכור ANR-10-LABX-0044 ו PSL ANR-10-IDEX-0001-02, את לא EpiGeneSys FP7. 257,082 רשת של אקסלנס EH, חוקר מתקדם ERC הפרס לא. 250,367 והאיחוד האירופי FP7 SYBOSS להעניק אין. 242,129 ל EH המחברים מבקשים להודות פלטפורמת הדמיה תאים ורקמות של גנטיקה מהמחלקה לביולוגיה התפתחותית (UMR3215 / U934) של קירי Institut, חבר צרפת-bioimaging (ANR-10-InSb-04), עזרה עם אור מיקרוסקופיה.

נהלים בעלי חיים בוצעו בהתאם הטיפול בבעלי החיים המוסדי המאושר ולהשתמש ועדה של קירי Institut (CEEA-IC) הפרוטוקולים (C 75-05-18). העבודה גם נערך תחת אישור ממשרד צרפתית להשכלה גבוהה ומחקר לשימושם של אורגניזמים מהונדסים גנטית (מספר הסכם 5549CA-I). 1. הכנת סעיפי cryostat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים מן מבייצת באופן טבעי F1 C57BL / 6 x DBA / 2J עכברים כמתואר שיאה et al., 12. ביום 7 של ההריון (E7), להקריב העכבר 8-12 בן שבוע על ידי נקע בצוואר הרחם. אסוף את decidua כלומר conceptus כולו 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד E7 conceptuses, כמתואר שיאה et al., 12. מניחים אותם בצלחת פטרי 60 מ&quot;מ המכיל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את conceptus העכבר E7 סעיפים cryostat. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בארות רדיד אלומיניום מותאמות 1cm בגובה ( &quot;תוצרת בית&quot; באמצעות פיפס זכוכית פסטרet). להפקיד ירידה של המדיום הקפאת רקמות בחלק התחתון של מיכל הקטנה הזו. להפקיד את conceptus בכיוון הנכון (כלומר, עבור סעיפים אורכים conceptus צריך לשמור על הכיוון האופקי שלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המכיל את conceptus היטב עם רקמות הקפאה בינוניות. להשעות אותו עם מלקחיים אדי מעל נוזלי N 2 על מנת לאפשר לו לקפוא לאט - אז לטבול לחסום בנוזל N 2 למשך מספר שניות עד שהוא הופך לבן. בהמשך לכך, להעביר את הבלוק לתוך בקבוקון הקפאה ולאחסן ב -80 ° C (ניתן לאחסן במשך מספר חודשים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני-חתך קריו, את הגוש הקפוא המכיל את conceptus ב -20 ° C ב cryostat למשך 30 דקות. בצע cryosections של עובי 8 מיקרומטר. סעיפי פיקדון 4 בשקופית כדי לאפשר התקשרות יעילה. סעיפי מקום קרובים מספיק כדי להתאים את עצמו coverslip 2 18 x 18 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את האיכותסעיפים (ללא פגע וללא סריטות) ואת הכיוון של העובר (סעיפים אורכים) עם סטראו ולבחור את החלקים מתאימים לניתוח נוסף. מהר ככל האפשר להפקיד אותם בצנצנת coplin ולבצע RNA FISH (ראה 3.3.2). </li></ol> 2. הכנת TGCs משנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את conceptus (ראה סעיף 1.1 ו -1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את E7 Ectoplacental קונוס (EPC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סטראו ו צלחות פטרי המכילות PBS סטרילית. לנתח את decidua עם מלקחיים. פירס מדגם מלקחיים פתוחים לקרוע שני הצדדים של decidua בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלם את העובר. השתמשו טיפים של מלקחיים בסדר סגורים (דומון מס &#39;5) בתובענה מספרית דמוי להפריד את EPC מעובר נכון. השתמש טיפול מיוחד על מנת להשיג מדגם נקי לחלוטין, להפריד מרקמות אימהיות כמו גם מן השק סיסי וחלמון. יש לשטוף היטב את explants EPC ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כף מעט, להעביר EPC גזור הפרט א-wel 4צלחת l המכיל coverslip סטרילי במדיום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור TGCs מתרבויות לזמן קצר EPCs. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות 4-היטב המכילות coverslips. לעקר 12 מ&quot;מ קוטר עגול זכוכית coverslips ידי טבילה באתנול, ואחריו-ייבוש להבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל בינוני EPC היטב כל (בינוני EPC: RPMI 1640 בתוספת 15% FCS, 0.1mm 2-mercaptoethanol ואנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחיד מיזוג אויר, גזור-EPCs במרכז של coverslip בבאר יחד עם המדיום לתרבות. שימוש במלקחיים בסדר ליישם את EPC על coverslip הזכוכית. Culturefor 3-5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. Explant הפרט מהווה תולדה שמתפשט כמו בשכבה של TGCs שטוח (איור 2 א). </li></ol></li></ol> 3. RNA FISH הערה: הפרוטוקולים מבוססים על אלה המתוארים עבור תאי גזע עובריים (ESCs) ב Chaumeil ואח &#39;, 8 ו Pollex ושמעתי 13.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתקדם Prepaמנה של פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן pH חיץ נתרן יצטט 3M 5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ הכלאה 2x המכיל 40% (w / v) סולפט dextran נתרן, 20x BSA, 400 מ&quot;מ Vanadyl Ribonucleoside מורכבים (VRC) ב 4x מלוחים סודיום ציטראט (SSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן הרכבה בינונית המכילים 90% (v / v) גליצרול, 0.1% (w / v) p-phenylenediamine, pH 9 ב PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות מוכנים טרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מקבע מורכב 3% מוכנים טרי paraformaldehyde (PFA) ב- PBS. הכן פתרון permeabilization המכיל 0.5% Triton-X-100 ב PBS בתוספת 2 מ&quot;מ VRC. הכן חיץ לשטוף על ידי ערבוב 50 לפוראמיד% (FA) ו 2x SSC ולהתאים את ה- pH ל 7.2-7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון ה- DNA נגד מכתים המורכב DAPI 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) ב 2x SSC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע Permeabilization כהכנה FISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים על coverslips, לשטוף התאים PBS 1x במשך 5 מ &#39;ב. תקן תאים על coverslips, או חלקים עובריים בשקופיות, במשך 10 דקות ב מקבע (3% PFA) פתרון ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1X PBS. Permeabilize תאים למשך 5 דקות בתמיסת permeabilization קר כקרח על קרח. שטפו תאים שלוש פעמים עם אתנול 70%. coverslips חנות צלחות 4-היטב שקופיות תיבת טיסה 4 שקופיות באתנול 70% ב -20 ° C. הערה: Coverslips ומגלשות יכולים להיות מאוחסנים במשך מספר חודשים ב -20 ° C. צלחות קופסאות המכילות אותם צריך להיות אטום עם parafilm כדי למנוע אידוי אתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג DNA Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל בדיקות DNA על ידי תרגום ניק באמצעות נוקלאוטידים ניאון. פעל על פי הוראות היצרן (ראה טבלה 1) 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תערובת תגובה 50 μl, להוסיף 1-2 מיקרוגרם של פלסמיד, כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BAC) או הגברת עקירה מרובה (מד&quot;א) (הגברת DNA, ראה 3.4.4) DNA 17.5 מי μl 2.5 μl 0.2 מ&quot;מSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 μl 10 מ&quot;מ כל תמהיל dNTP (dGTP, dATP, dCTP), 5 μl 10 מ&quot;מ dTTP, 5 μl חיץ תרגום ניק 10x ו -8 μl האנזים התרגום ניק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 16 שעות ב 15 ° C בחושך. להשבית את התגובה על ידי הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס. בדיקות חנות במשך חודשים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מד&quot;א הערה: לקבלת DNA BAC, כמות ה- DNA המתקבל לאחר הכנה קלסית היא נמוכה, ולכן ניתן להשתמש צעד של הגברת DNA לפני התיוג באמצעות מד&quot;א. השתמש ערכה מסחרית ופעל לפי הוראות היצרן (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 0.5 μl DNA BAC עם 9.5 חיץ מדגם μl. מחממים 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. מיד להרוות על הקרח; להשאיר על 10 דקות קרח. כן תגובת חיץ / תמהיל אנזים: (9.5 μl + 0.5 תמהיל אנזים μl) ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 תמהיל μl תערובת DNA + 10 μl התגובה חיץ / האנזים. לדגור על 20 שעות 30 מעלות צלזיוס לפחות. להשבית אנזים על ידי מדגם חימום 10 דקות ב 65 &amp; #176; ג. מדגם מצנן 4 ° C לפני האחסון ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מד&quot;א על ​​ידי עיכול. הוסף 1 μl מד&quot;א, 2 μl 10x חיץ, 2 μl הינד III ו- 15 μl H 2 O. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הפעל לאט על ג&#39;ל agarose 0.8-1% כדי לאשר הגברת DNA מדויקת. קטעי דנ&quot;א ברורים של משקל מולקולרי גבוה יש לשים לב על הג&#39;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 0.1 או 1 מיקרוגרם בדיקה לכל coverslip או שקופיות. הערה: להוסיף 2-5 מיקרוגרם של ה- DNA מיטת-1 אם תחרות נדרשת למשל, רוב הבדיקות כפי שהם יכולים להכיל רצפים חוזרים אשר אחרת לחצות להכליא ולהגדיל ברקע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת ממטרים, להוסיף DNA זרע סלמון 5 מיקרוגרם, 1/10 נפח 3 M pH אצטט נתרן 5.2 ו -3 כרכים אתנול. ספין על XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. לשטוף כדורים עם אתנול 70% ומסובבים שוב במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה יבשה 2 דקות בתוך VAC רכז / מהירות. Resuspend בצורה 100%אמיד בחצי נפח נדרש הכלאה (למשל, 2.5 μl עבור coverslip או 7 μl עבור סעיפים עובריים בשקופית). מניחים 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד בתוך thermomixer. לפגל עבור 7 דקות ב 75 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות על הקרח, או אם התחרות נדרש לשים ישירות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. מערבבים את הפתרון בדיקה עם נפח שווה של פתרון הכלאה 2x. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה ושוטפת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְיַבֵּשׁ; coverslips בבארות, ומגלשות בצנצנת Coplin, על ידי שטיפה רציפים 1x 80%, 1x 95% ו 100% אתנול 2x עבור 5 דקות כל אחד. coverslips ושקופיות יבשות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הכלאה, להחיל את תערובת הכלאה בדיקה 5 μl (ראה 3.5) לשקופית ולהפחית את coverslip, עם תאים מול לתערובת הכלאה. עבור חלקים בשקופית, להחיל לערבב הכלאה בדיקה 14 μl (ראה 3.5) ומכסים עם coverslip 18 x 18 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית בתא לח (נייר טישו טבול50% FA / 2x SSC) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוחץ פוסט כלאה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 50% FA / 2x SSC על coverslip בשקופית כדי לשחרר אותו; להסיר את coverslip בזהירות משקופית (נזהרת שלא לגרד את התאים) ולמקם אותו בצד התא למעלה לתוך צלחת 4-היטב המכיל 50% FA / 2x SSC. עבור חלקים בשקופית, להסיר את coverslip באופן דומה במקום להחליק בצנצנת Coplin המכיל 50% FA / 2x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 שוטף, כל אחד 7 דקות עם SSC מחומם מראש 50% FA / 2x ב 42 מעלות צלזיוס או 44 מעלות צלזיוס למשך coverslip או שקופיות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 שוטף עם מחומם מראש 2x SSC במשך 5 דקות כל אחד ב 42 מעלות צלזיוס או 44 מעלות צלזיוס למשך coverslip או שקופיות, בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain גרעינים ידי שטיפה ב 2x SSC עם 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI דקות 3 ב RT. יש לשטוף פעמיים עם 2x SSC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת Coverslips ומצגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור coverslip קטן מ TGCs תרבותי, להחיל 5 &amp; #181; l הרכבה בינונית בשקופית. מניח את התא בצד coverslip למטה על גבי הירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שקופיות עם קטעים, להחיל 15 μl הרכבה בינונית בשקופית. מניחים coverslip מ&quot;מ 2 22 x 22 על גבי ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע בועות. לקנח פתרון הרכבה עודף. חותם את coverslip עם כמות קטנה של לק. במידת האפשר, תמונה שקופיות מיד או חנות של עד מספר חודשים ב -20 ° C. </li></ol></li></ol> מיקרוסקופיה וניתוח 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות ציר 3D רציפים z ב 0.3 מיקרומטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 63X) ולבצע ניתוח של ערימות התמונה 3D באמצעות תוכנת ImageJ 14. </li></ol>

<ol>
	<li>Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+trophoblast+differentiation+and+placental+morphogenesis.">Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).</li><li>Zybina, E. V., Zybina, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polytene+chromosomes+in+mammalian+cells.">Polytene chromosomes in mammalian cells.</a> Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).</li><li>Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+chromatin+status+and+organization+of+the+inactive+X+chromosome+in+murine+trophoblast+giant+cells.">Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells.</a> Development. 140, 861-887 (2013).</li><li>Rossant, J., Tamura-Lis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+diploid+to+giant-cell+transformation+in+postimplantation+mouse+trophoblast.">Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).</li><li>El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+differentiation+in+vitro:+establishment+and+characterization+of+a+serum-free+culture+model+for+murine+secondary+trophoblast+giant+cells.">Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells.</a> Reproduction. 128, 53-71 (2004).</li><li>Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+inactivation+and+the+complexities+of+silencing+a+sex+chromosome.">X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome.</a> Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).</li><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+dynamics+of+imprinted+XCI+during+early+mouse+development.">Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development.</a> Science. 303, 644-664 (2004).</li><li>Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+de+novo+imprinted+X-chromosome+inactivation+independent+of+meiotic+inactivation+in+mice.">Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice.</a> Nature. 438, 369-373 (2005).</li><li>Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+paternal+X-chromosome+activity+during+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).</li><li>Geijsen Shea, K., N, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).</li><li>Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+combined+with+immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+study+the+nuclear+dynamics+and+expression+of+the+X-inactivation+center.">Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center.</a> Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFPA+award+in+placentology+lecture+-+characteristics+and+significance+of+trophoblast+giant+cells.">IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells.</a> Placenta. 29, 4-9 (2008).</li><li>Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+expression+of+trophoblast-specific+genes+during+formation+of+mouse+trophoblast+giant+cells+in+vitro.">Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro.</a> Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Rnf12/RLIM+is+required+for+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Nature. 467, 977-981 (2010).</li><li>Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+single+cells+within+tissue.">Gene expression profiling in single cells within tissue.</a> Nat Methods. 9, 663-665 (2005).</li><li>Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).</li><li>Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+infection+and+gene+expression+in+clinical+tissue+specimens+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).</li><li>Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+development+and+evolution+of+the+placenta.">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24, 123-130 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ינוקא RNA FISH מייצג שיטה קלה ורגישה לניתוח התא הבודד של פעילות תעתיק ברקמות עובריות בשלבי התפתחותיים שונים. כוחה של גישה זו הוא היכולת לזהות שושלות עובריות שונות בכל שלב מסוים על פי קריטריונים מורפולוגיים. עם זאת זה גם דורש כי קרינת רקע מינימאלית היא הווה. כל רקע כזה הופך את זיהוי של אזורים עובריים שונים סוגי תאים מאתגרים. כדי להבטיח רקע מינימלי, ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא איכות cryosection והשנייה הוא היעילות (יחס אות לרעש) של דג RNA, אשר תלוי ברמת ביטוי גנטי ואת האיכות של החללית. עבור אלה האחרונים, בדיקות ולכן נבחנים תמיד על תאים בתרבית על coverslips (תאי גזע עובריים או תאים סומטיים) לפני השימוש על סעיפים. בפרוטוקול זה, אנו מספקים ה<html> טכניקות דואר נדרשו לבצע ניתוח FISH RNA על TGCs משני סוגים שונים של הכנת מדגם (סעיפי cryostat ותרבויות עיקריות של explants העוברי). כזה ניתוח תא בודד מאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בשלבים שלאחר השתלה שונות יוערכו. השיטות אנו מתארים ליצור TGCs משנית (ב E7-7.5 בשלבים שלאחר ההשתלה) שימשו במעבדה שלנו לחקור את דפוסי איון כרומוזום X של השושלת חוץ עובריים אשר היוו של TGCs בשלבים שלאחר ההשתלה. פיתוח חוץ עוברי במכרסמים תלוי הבידול של TGCs. ואכן, TGCs חיוני שליה ולכן התפתחות עוברית. פגמי בידול TGC לגרום הקטלניות עובריות (לסקירה ראה התייחסות 15). פעילות תעתיק של TGCs באמצעות RNA FISH מותר לנו להפגין מעמד איון חריג כרומוזום X של תאים מסוג כזה במהלך העכבר פיתוח 3. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; השיטות שהוצגו כאן כדי לקבל וללמוד TGCs משנית ניתן להחיל ללמוד מסלולים מולקולריים בפיתוח של רקמות חוץ עובריים הם חשובים חלק, הן בעכברים נורמליים מוטציה. גישות אלה יכולים להיות מותאמים לחקור פיתוח TGC ביונקים אחרים. הניתוח שלנו מעורבים השימוש של עוברי עכברים סוג בר המאפשר לנו להעריך את פעילות תעתיק של גנים שונים in vivo TGCs וב TGCs במבחנה נגזר explant EPC. שיטה זו יכולה להתארך עד הניתוח של עכברים מהונדסים ו / או על ידי התוספת של מולקולות מעכבות במדיום התרבות. השתמשנו בהצלחה בשיטה זו של RNA FISH על סוג אחר של TGCs, כגון TGCs העיקרי אשר מופיע בשלב מוקדם יותר של התפתחות עכבר, blastocyts E3.0, אשר יכול להיות בנפרד בתרבית למשך 4-5 ימים במהלך שפתחו תולדה, את ICM להיות מוקף TGCs העיקרית הגדולה 16,17. תמלילי המתהווה עבור שונהגנים וכן Xist יכול להיות דמיינו לכמת באמצעות הגישה FISH אותו RNA 3. Immunofluorescence משולב ו- RNA FISH יכול להתבצע גם על סעיפים cryostat וכן TGCs בתרבית במבחנה 3. מכך ניתן להסיק כי השיטה היא די חזקה, כמו תמלילי העיקריים הם רגישים מאוד שפל ויש דרישה מוחלטת של תרכובות חינם RNase. IF / RNA FISH מספק מידע נוסף על רמות שעתוק, לוקליזציה הסלולר ביטוי חלבון, בו זמנית בתא נתון. אמנם, קטעי רקמה פרפין מוטבע בעבר שימשו כדי לזהות RNA המתהווה בגידולים אנושיים תוך שמירה על מורפולוגיה רקמות 18, בידינו, סעיפים cryostat מתאימים כפולה ומכופלת לשמר הן את RNA המתהווה ואת אפיטופים נדרש לגילוי על ידי נוגדנים במהלך immunofluorescence . בנוסף RNA FISH, בעקבות immunofluorescence, כרומוזומליות DNA FISH יכול להתבצע גם על TGCs משנית באמצעות בדיקות שכותרתו עם fluorochromes, בדומה לאלה המשמשים RNA FISH 3. בדיקות ניאון יכול להיות פלסמידים / fosmids או BACS, שכותרתו עם dUTPs פלורסנט כפי שמוצג כאן, ותיאר Chaumeil et al., 8. לחלופין, oligonucleotides שכותרתו fluorescently יכול לשמש 19. מאז DNA FISH אינו מחייב גדיל-סגולי, בדיקות oligonucleotide יכולה להיות מתוכננות למקד אחד משני הגדילים משלימים באזור היעד. בדיקות דנ&quot;א מסועפים, שבו הגברת אות מושגת על ידי שני סיבובים רציפים של בדיקות ספציפיות ומגבר יכולות לשמש גם כדי לשפר את יחס אות לרעש של אותות FISH 20. לחלופין, בדיקות RNA כגון riboprobes יכולות לשמש אם כי בדיקות דנ&quot;א שלנו להבטיח תחלופה טובה יותר בין איכות אות, סגולי וקל שימוש. לבסוף, acquisiti תמונת 3Dעל חיונית על מנת להשיג את המידע המרחבי הנדרש תאים גדולים אלה, והוא יכול להתבצע באמצעות מגוון של מיקרוסקופים הקרינה, כגון המיקרוסקופ Apotome, או מיקרוסקופים epifluorescence עם deconvolution כגון DeltaVision (geh), או מיקרוסקופים אחרים מתאימים עבור סעיפי רקמות הדמיה, וגדולים (&gt; 20 מיקרומטר) TGCs. יצוין כי עבור לוקוסים דנ&quot;א עותק יחיד, האות punctate זוהה על ידי FISH RNA המתהווה או FISH DNA לא יזוהו בקלות על ידי מיקרוסקופיה confocal. לסיכום, השיטות המתואר כאן צריכות להיות שימושיות הן עבור הניתוח המפורט של TGS בהקשר התפתחותי, אלא גם במצבי מחלה אחרים. גנים רבים שמעורבים בפיתוח TGC ותפקוד במכרסמים שמורים בין מכרסמים ובני האדם, כגון גורמי תעתוק, פרוטאזות ומולקולות הידבקות תא 21. עכבר TGCs הוא מודל תא עבור גנים לומדים מווסתי התפתחות שליהד ולכן לתת תובנה מחלות שליה אנושיות. יתר על כן, בשל העובדה כי תאים אלה הם endoreplicating ומאז כמה תאים סרטניים לעסוק תוכניות endocycle, בנוסף לתהליכי הגברת גן, השיטות אנו מתארים צריכות גם להיות מועילות בחקירות תא בודדות נדרשו לחקור מנגנונים מובילים הגנום חוסר יציבות בתאי סרטן .

תאים ענקים trophoblast יונקים (TGCs) מהווים מחסום בין רקמות אימהיות עובריות. הם לתווך השתלה ופלישה של conceptus לתוך הרחם ממלא תפקידים קריטיים בהתפתחות להיווצרות של השליה. הם מייצרים גורמי גדילה אחדים (ציטוקינים) והורמונים של המשפחה לקטוגן הפרולקטין / שלית הסטרואידים, הכרחית לצמיחה עוברית והישרדות. TGCs גדול, mononucleated ו polyploid תאים עם מחזור תא, endocycle, שמורכב לסירוגין שלבי S ו- G. ואכן, TGCs הוא endoreplicating תאים, מסוגלים לעבור סבבים רבים של סינתזת ה- DNA ללא כל חלוקה 2. על מנת לחקור את מצב תעתיק של גנים in vivo, ב TGCs לעומת סוגי תאים עובריים extraembryonic אחרים, FISH RNA המתהווה ניתן לבצע in vivo על סעיפים cryostat 3 בשלבים שלאחר ההשתלה ספציפיים. TGCs ניכרים בקלות על סעיפים בשל their גודל גדול ופעילות גן התעתיק שלהם ניתן להקליט אך מספרם בשלבים שלאחר השתלה מוקדם הוא נמוך. מיעוט TGCs על סעיפים עובריים E7, הוביל אותנו לבצע לטווח קצר תרבויות של רקמות trophectodermal עובריים להשיג TGCs הבדיל כדי ללמוד את הרגולציה של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות trophectoderm. יתר על כן, על מנת להישאר פיסיולוגי ככל האפשר, שורות תאים הוקמו כלומר trophectoderm תאי גזע (TS) הם לא תמיד מתאימות לחקור דור מנגנוני התפתחותי של TGCs המשנית לספק כלי רב ערך כדי ללמוד הריונות פתולוגי קשורים לפגמי TGCs בשל גן נורמלי תקנה בעכברים. תאים Trophoblast של חרוט ectoplacental (EPC) הם סימנים מקדימים של TGCs משנית 4. התמיינות ספונטנית של EPCs תרבותי משנית TGCs כבר בעבר דווח 5. עם זאת, בניגוד TGCs העיקרי, מחקרים על בידול משני TGCtiation נותר מוגבל, presumablydue לקשיים לבודדים explants EPC ללא כל רקמות של האם או עובר. מתאמנים שיטות אלה, על מנת לבצע FISH RNA על TGCs משנה מכחו מעובר פרט E7, שלב התפתחותי לאחר השתלה שבו TGCs מעט מאוד אבל יכול להיות שנוצר מבשרי EPC. FISH RNA לנתח תמלילים עיקריים גרעיניים מעולם לא נעשה ברמה ברמת התא הבודדה על TGCs המשנית. אופציה זו מאפשרת ניתוח מדויק של שעתוק שימש כדי להראות את חוסר היציבות אפיגנטיים של TGCs בשלבים שלאחר ההשתלה 3. דוגמה קלאסית של אפיגנטיקה ביונקים, את איון כרומוזום X (xci) נלמדת במעבדה הרד 6. בתהליך זה אחד 2 הכרומוזומים X ב הנקבה מומת. המגזר השקלי הלא צמוד קידוד מעילים תמליל Xist כרומוזום X שממנו הוא בא לידי ביטוי בתאים נקבה ומפעיל השתקת ברוב הגנים. באמצעות FISH RNA,תמלילי מתהווה של גני X-linked יכולים להיחקר כפי שניתן את ההצטברות של Xist RNA על כרומוזום X הפעיל (Xi). אנו מתארים כאן הליך לבצע RNA FISH על סעיפים של עוברים לאחר ההשתלה ועל לטווח קצר תרבויות של EPC. פרוטוקול זה מותאם מאלה ששמשו ללמוד xci להבדיל מתאי גזע עובריים נשיים עוברת preimplantation 7-11. אנו מספקים דוגמאות של xci בעוברים נקבה in vivo, כמו גם במבחנה TGCs.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td>MC19</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Roth</td><td>PK78.1</td><td></td></tr><tr><td>4-well tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dishes Falcon</td><td>Dutsher, France</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dishes Falcon</td><td>Dutsher, France</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 18 mm x 18 mm&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 mm x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>12 mm glass round coverslips&amp;nbsp;</td><td>Harvard apparatus</td><td>64-0712</td><td></td></tr><tr><td>Slides Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>4-slide Transport&amp;nbsp; box&amp;nbsp; Lockmailer</td><td>Dutsher, France</td><td>40684</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes 1.8 ml Corning&amp;nbsp;</td><td>Fisher Science</td><td>10418571</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coplin staining jars</td><td>Fischer Scientific</td><td>W1561L</td><td></td></tr><tr><td>TissueTek O.C.T compound</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Invitrogen</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10x&amp;nbsp; is used</td></tr><tr><td>Water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Panreac Quimica, Spain</td><td>141451</td><td>3% in PBS</td></tr><tr><td>Triton-X-100&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>&amp;nbsp;2000-A</td><td>0.5% final</td></tr><tr><td>Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dextran sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp; (BSA)</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td>&amp;nbsp;aliquots kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Illustra TempliPhi&amp;nbsp; Kit Construct (Kit MDA)</td><td>Dutsher, France</td><td>25-6400-80</td><td></td></tr><tr><td>Nick translation kit</td><td>Abbott, USA</td><td>07J00-001</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC buffer concentrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S6639</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum green dUTP&amp;nbsp;</td><td>Abbott, USA</td><td>02N32-050</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum red dUTP&amp;nbsp;</td><td>Abbott, USA</td><td>02N34-050</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 dUTP&amp;nbsp;</td><td>Dutsher, France</td><td>PA55022</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cot-1 DNA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440016</td><td></td></tr><tr><td>DNA, MB grade</td><td>Invitrogen</td><td>Roche</td><td>DNA from fish sperm</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>p-phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695106</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf, Germany</td><td></td><td>molecular biology grade</td></tr><tr><td>Eppendorf concentrator plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquiport Liquid pump</td><td>KNF Neuberger, Trenton, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shake&#039;N&#039;Bake Hybridization oven</td><td>Boekel Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptional analysis by nascent rna fish of in vivo trophoblast giant cells or in vitro short-term cultures of ectoplacental cone explants

השליה נובעת שושלת חוץ עוברית אחד, trophectoderm. בשנת הבלסטוציסט murine פרי-ההשתלה, תאים trophectoderm ציור קיר להתמיין לתאי ענק trophoblast העיקרי (TGCs) בעוד trophectoderm הקוטב שמעל מסת התאים הפנימית ממשיך להתרבות הבחנה מאוחר יותר לתוך TGCs משנית. TGCs לשחק תפקיד מפתח בפיתוח השליה חיוני הריון מוצלח. חקירת תקנת תעתיק של גנים ספציפיים במהלך הפיתוח לאחר השתלה יכולה לתת תובנה פיתוח TGCs. תאים של חרוט ectoplacental (EPC) מעוברים ב 7-7.5 ימים של ההיריון (E7-7.5), נגזר trophectoderm קוטב, להתמיין TGCs משנית 1. TGCs ניתן ללמוד באתרו, על סעיפי cryostat של עוברי E7 אם כי מספר TGCs נמוך מאוד בשלב זה. קיימות דרכים אחרות של ניתוח TGCs המשנית היא להשתמש לטווח קצר תרבויות של EPCs הפרט מעובר E7ים. אנו מציעים טכניקה לחקור את סטטוס התעתיק של גנים של עניין הוא in vivo ו במבחנה ברמת התא הבודד באמצעות ניאון הכלאה באתרו (RNA FISH) כדי לחזות תמלילי מתהווה. טכניקה זו מספקת הודעה ישירה של ביטוי גנים ומאפשרת הערכה על מצב כרומוזומליות של TGCs, אשר הוא תאי endoreplicating גדולים. אכן, תכונת מפתח של בידול הטרמינל של TGCs היא שהם לצאת ממעגל התא לעבור סבבים רבים של הגישה endoreplication.This ניתן ליישם כדי לזהות ביטוי של כל גן לידי ביטוי מתוך אוטוזומים ו / או כרומוזומי המין והוא יכול לספק מידע חשוב לתוך התפתחותי מנגנונים כמו גם מחלות השליה.

TGCs ניתן לזהות על סעיפי E7 על מכתים DAPI בשל הלוקליזציה שלהם conceptus והגודל הגדול שלהם. זה מתואר באיור 1A על קטע אורך. RNA FISH בוצע על סעיפים עובריים כאלה כדי ללמוד איון כרומוזום X בשושלת חוץ עוברי זה. שקופיות או coverslips כמה יכול להיות מעובד בו זמנית. באמצעות צבעים שונים לתייג RNA של גנים שונים, אפשר להבחין תמלילים עיקריים שונים באותה הגרעין. לפחות 2 בדיקות יכולות להיות מעורבות יחד, למשל Xist מצמיד SG (אות ירוקה) Atrx מצמיד את SR (האות אדומה). דוגמא נקבת TGC מוצגת באיור 1B שבו 2 שושלות אחרות מיוצגות, העובר התקין (E) ואת האנדודרם הקרבי (VE). גרעין TGC מוצג עם RNA Xist מכסה את Chrom Xosome אשר מומת (Xi) ואילו כרומוזום X השני הפועלת (Xa) מציג כמה סיכה. X-linked גן התמלילים העיקריים Atrx באים לידי ביטוי מן כרומוזום X הפעיל (מעוצב לא על ידי Xist) בכמה עותקים בשל endoreplication. זה ממחיש למשל הביטוי monoallelic, איון של Atrx על כרומוזום X אחד. מאז TGCs הוא הטרוגניים בגודל כפי שמודגם באיור 2B, רק אלה הגדולים נרשמים. שלושה בדיקות יכול לשמש גם כפי שמודגם באיור 2C עבור TGCs משנית. במקרה זה, Xist -SG (ירוק), שני גנים צמודים X: G6PD -SR (אדום) ו Huwe1 -Cy (מג&#39;נטה) נותחו באותו הזמן באותו הגרעין. בעוד G6PD מתבטא monoallelically כפי שמוצג כאן (ועוד קודם לכן שמוצג TGCs משני 3) Huwe1 מתבטא biallelically הוכחת PR שלהoperty לברוח xci. Endoreplication, עם כמה ראשי סיכה כלומר, עותקים תמלילי המתהווה, ניכר גם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig1.jpg" /> באיור 1. ביטוי תמליל עיקרי TGCs ממדור עוברי נקבת E7. (א) בסעיף האורך של conceptus E7 מוכתם DAPI. העובר ורקמות חוץ עוברי מוקפים ברקמת האמא, את decidua. הלוקליזציה של השושלות השונות נעשתה על מכתים DAPI עם מטרת 5X. TGCs מזוהה בשל הגודל הגדול שלהם. Ch, סיסי, E, עובר, EPC, חרוט ectoplacental, VE, endoderm הקרבי, TGC, תאים ענקים trophoblast. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) הגדלה גבוהה של אזור התאגרף-ב א (המטרה 63X) FISH RNA. תמליל העיקרי Atrx ב RNA אדום Xist בירוק הם דמיינו על E 3 שושלות =, VE, TGC. Scאייל בר = 10 מיקרומטר. דוגמה in vivo TGC שבו Atrx מתבטא monoallelically (Xa, ראש חץ) ושקט הממוקם על כרומוזום X. Xist מצופה (Xi); כמה אותות Atrx לראות על Xa נובעים endoreplication. Atrx = BAC שיבוט RP23-260I15. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig2.jpg" /> איור 2. ביטוי תמליל עיקרי TGCs משני נגזר EPC. (א) מראה כללי של גדל TGCs המשנית (אובייקטיבי X5). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) כוכבית מצביעה דוגמא TGCs פי גודלם (אובייקטיבי 10X). בר סולם = 60 מיקרומטר. דוגמה (C) של נקבה משני RNA TGC FISH עם שימוש של 3 בדיקות (Doma Xistב בירוק, המכסה את כרומוזום X המומת: Xi) מראה endoreplication של תמלילים עיקריים G6PD ו Huwe1 (כמה ראשי סיכה, באדום מגנט). בעוד G6PD מתבטא monoallelically, ביטוי Huwe1 הוא biallelic בגרעין זה Huwe1 = BAC שיבוט RP24-157H12;. G6PD = BAC שיבוט RP23-13D21. Xi = חץ; Xa = ראש חץ (אובייקטיבי 63X). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants at JoVE.com

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

transcriptional-analysis-nascent-rna-fish-vivo-trophoblast-giant

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

7.8K Views.  Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934. Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones. 

Video: Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genetics

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients and waste between the mother and fetus and the production and delivery of growth factors and hormones. Placental genetic manipulations in mice are critical for understanding the placenta's specific role in prenatal development. Placental-specific Cre-expressing transgenic mice have varying effectiveness, and other methods for placental gene manipulation can be useful alternatives. This paper describes a technique to directly alter placental gene expression using CRISPR gene manipulation, which can be used to modify the expression of targeted genes. Using a relatively advanced surgical approach, pregnant dams undergo a laparotomy on embryonic day 12.5 (E12.5), and a CRISPR plasmid is delivered by a glass micropipette into the individual placentas. The plasmid is immediately electroporated after each injection. After dam recovery, the placentas and embryos can continue development until assessment at a later time point. The evaluation of the placenta and offspring after the use of this technique can determine the role of time-specific placental function in development. This type of manipulation will allow for a better understanding of how placental genetics and function impact fetal growth and development in multiple disease contexts.

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Here we describe a time-specific method to effectively manipulate critical developmental pathways in the mouse placenta in vivo. This is performed through the injection and electroporation of CRISPR plasmids into the placentas of pregnant dams on embryonic day 12.5.

עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Biochemistry

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח אנגיוגנזה: בדיקת מבחנה להיווצרות צינורות על מטריצת BM

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

<meta charset="utf8"></head><body>התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של

Summary

Explore More Videos

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות